שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים
Summary
מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.
Abstract
למרות דלקת ריאות הנרכשת בקהילה נשארת אחת בעיות עיקריות בריאות הציבור, מודלים בעכברים של דלקת ריאות חיידקית הקלו התקדמות פרה-קלינית משמעותית לאחרונה בהבנתנו בפתוגנזה התאית והמולקולרית הבסיסית. בעכברי מודל vivo ללכוד פיזיולוגיה המשולבת ואיתנות תגובת ההגנה המארחת ב באופן לא נחשף על ידי גישות vivo לשעבר חלופיות, פשוט יותר. כמה שיטות תוארו בספרות עבור חיסון intrapulmonary של חיידקים בעכברים, כולל aerosolization, משלוח אפי, cannulation endotracheal Peroral תחת 'עיוור' ו דמיינו ההתניות cannulation endotracheal transcutaneous. כל השיטות יתרונות ומגבלות יחסית. בזאת, אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לא פולשנית, טכני שאינו עתירה, זולות, מהירה למסירת intratracheal של חיידקי מערבת שאיפה (כלומר, שאיפה) על ידי העכברשל בידוד זיהומיות pipetted לתוך הלוע התחתון בעוד תחת הרדמה כללית. שיטה זו יכולה לשמש למסירה ריאתי של מגוון רחב של גורמים ביולוגיים וכימיים שאינם מאכלים, והוא קל יחסית ללמוד, אפילו למעבדות עם ניסיון קודם מינימאלי לנהלים ריאתי. בנוסף לתיאור שיטת דלקת ריאות שאיפה, כמו כן אנו מספקים נהלים צעד-אחר-צעד עבור assaying את הפעולות הבאות in vivo התגובה החיסונית המולדת ריאתי של העכבר, בפרט, שיטות לכימות אישור חיידקים התגובה החיסונית התאית של דרכי האוויר הנגוע. גישה משולבת ופשוט זה להערכת דלקת ריאות מאפשרת הערכה מהירה וחזקה של השפעת מניפולציות גנטיות וסביבתיות על חסינות מולדת ריאתי.
Introduction
קהילה רכשה דלקת ריאות נשארת הגורם המוביל למוות כתוצאה מהזיהום בארה"ב, עם שינוי הכולל מעט בשיעורי תמותה ב -40 השנים האחרונות למרות שיפורי חיסון ואסטרטגיות אנטיביוטיות 1,2. למרות חוסר התקדמות ניכרת ברמת בריאות הציבור, בשנים האחרונות התקדמות דרמטית נעשתה הבנתנו בפתוגנזה המולקולרית התאית של דלקת ריאות, עם רבים של פעולות הבאות קדימה מתאפשרות על ידי השימוש במודלים של עכברים של דלקת ריאות. העקיבות הגנטיות של העכבר, הדמיון של murine ומערכות חיסון אנושיות, ואת המערך העצום של חומרים כימיים אימונולוגית במיקוד murine שהפך זמין מסחרי יחד הקלו התקדמות מהירה של השדה.
מודלי עכבר של דלקת ריאות חיידקית המתוארות בספרות יש לסמוך כלל על אחד ארבעה מסלולים טכניים עבור חיסון הפתוגן: אני aerosolization); ii) Intrמשלוח anasal; iii) משלוח Peroral; ו- IV) הזרקת intratracheal כירורגית (כלומר, קנה) 3. כל המסלולים של זיהום יתרונות וחסרונות 3. בפרט, חשיפה היחסית של דרכי הנשימה העליונות, פוטנציאל תערובת של צמחים oronasal, דרישות עבור הרדמה כללית, השתנות של הבידוד נמסר אל הריאות דיסטלי, הפצה אוֹנִי של פתוגנים נמסר, דרישות מומחיות טכנית, ותחלואה פרוצדורליים להשתנות משמעותית על פני אלה גישות.
נפוץ טכניקות זיהום Peroral כוללות endotracheal (translaryngeal) cannulation דרך או גישה 'עיוורת' (לא דמיין), או תחת ויזואליזציה בגרון ישירה 3-5. שני שיטות, תוך חזק, דורשות הכשרה משמעותית וגם לשאת בסיכון של טראומה על דרך הנשימה העליונה. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה טכנית שאינם עתירה, לא פולשנית, לא יקרה, ומהירה של זיהום Peroral, wחיידקים בזאת (Klebsiella pneumoniae בדוגמא המסופקת) pipetted לתוך הלוע התחתון של עכבר הרדים מועברים אל הריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה). אנו ואחרים השתמשנו בטכניקת דלקת ריאות שאיפה בהצלחה 6-9. שיטת ריאות-משלוח תכליתי ובקלות לומדת זה יכול להתארך עד המסיירת הרבה סוכנים שאינם מאכלים נוספים אל הריאות, כולל ציטוקינים וחלבונים אחרים, מולקולות הקשורים הפתוגן (למשל, lipopolysaccharide), תאים (כלומר, העברת מאמצת), ורעלים (למשל, בליאומיצין). בנוסף לדיון שיקולים טכניים חשובים, אנחנו גם לתאר גישה משולבת, כמוני להערכת התגובה המארחת לאחר דלקת ריאות, כוללים מדידה במורד זרם של שחרור חיידקים (כלומר, יחידת מושבה להרכיב [CFU] quantitation באיברי הריאות היקפיות) ו לויקוציטים הצטברות במרחב האווירי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים Murine של דלקת ריאות חיידקית, שותפות עם מיקוד גנים in vivo התערבויות ביולוגיות תרופתי, סיפקו תובנות קריטיות לתוך התגובה ההגנה המארחת ריאתי. התקדמות גדולה נעשתה בפרט בהבנתנו של כמוקינים ומולקולות דבקות השולטים גיוס של נויטרופילים הכניסה למרחב האוירי הנגועה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
References
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
