Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Daryl Sivakumaran; Emilia Bakaic; Scott B. Campbell; Fei Xu; Eva Mueller; Todd Hoare

doi:10.3791/54502

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생체공학

Изготовлении разложению Thermoresponsive гидрогелей на различных масштабах длины через реактивной экструзии, микрофлюидика, самостоятельной сборки и Electrospinning

Published: April 16, 2018

doi:

10.3791/54502

Daryl Sivakumaran¹, Emilia Bakaic¹, Scott B. Campbell¹, Fei Xu¹, Eva Mueller¹, Todd Hoare¹

¹Department of Chemical Engineering,McMaster University

Summary

Для изготовления разложению thermoresponsive гидрогели на основе гидразоны сшивки полимерных олигомеров на массовых масштабах, микромасштабной и наноразмерных, последний для приготовления геля наночастиц и nanofibers описываются протоколы.

Abstract

Хотя различные умные материалы были изучены для различных биомедицинских приложений (например, Доставка лекарств, тканевая инженерия, bioimaging, и т.д.), их конечной клиническое использование сдерживается отсутствием биологически соответствующих деградация наблюдается наиболее умные материалов. Это особенно верно для температуры отзывчивым гидрогели, который почти равномерно основе полимеров, которые функционально не разложению (например, poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) или поли (oligoethylene гликоль метакрилат) (POEGMA) ). Таким образом чтобы эффективно перевести потенциал thermoresponsive гидрогелей на вызовы дистанционным или регулирует метаболизм лекарств, ячейка подмости с перестраиваемой клеточный материал взаимодействия, theranostic материалы с потенциалом для изображений и доставки лекарств и других таких приложений метод необходим для отображения гидрогели (если не полностью разложению) по крайней мере способный почечного клиренса после требуемый срок службы материала. С этой целью этот Протокол описывается подготовка гидролитически разлагаются гидразоны сшитый гидрогели на нескольких длина шкалы, основанный на реакции между гидразида и альдегид функционализированных олигомеров PNIPAM или POEGMA с молекулярной веса ниже предела почечной фильтрации. В частности, методы изготовления разложению thermoresponsive массовых гидрогели (методом двойной баррель шприца), гидрогеля частицы (на обоих микромасштабной благодаря использованию платформы микрофлюидика, облегчения одновременного перемешивания и Эмульгирование прекурсоров полимеров и наноразмерных благодаря использованию термически управляемый самосборки и cross-linking метод), гидрогеля nanofibers (с использованием стратегии реагирования electrospinning) описаны и. В каждом конкретном случае может быть достигнуто гидрогели с температуры отзывчивым свойства аналогичны достигнуто с помощью обычных свободнорадикальных процессов структурообразования, но гидразоны сшитого сети может снизиться со временем сформировать заново олигомерных прекурсоров полимеров и включить специальные акции. Таким образом мы ожидаем, что эти методы (которые могут быть родово применительно к любой синтетический водорастворимый полимер, не только умные материалы) позволит легче перевод синтетических “умные” материалы для клинического применения.

Introduction

“Умные” материалы привлекли большое внимание из-за их потенциал для обратимых «по требованию» ответы на внешние и/или экологические сигналы. Температура отзывчивым материалы привлекли особый интерес из-за их ниже критические решения температуры (СМЕШЕНИЯ) поведения, что приводит к инициативе температуры осадков при температуре T > СМЕШЕНИЯ¹^,². В контексте thermoresponsive гидрогелей, поведение температуры ниже критические решения проявляется реверсивные опухоль/де-swelling события, которые приводят в температуры перестраиваемый массовых размеров (больше при T < СМЕШЕНИЯ)³, порами размером (при T < СМЕШЕНИЯ)⁴и межфазного свойства (более гидрофильные, при T < СМЕШЕНИЯ)⁵. Такие переходы широко применялись в доставки лекарств (для внешних или экологически triggerable наркотиков релиз⁴^,⁶^,⁷), инженерные и клетки культуры ткани (для термореверсивные клеточной адгезии / расслоение⁸^,⁹^,¹⁰), цветоделения (для переключаемых мембраны пористости и значениями μ или термически переработке диагностических поддерживает¹¹^,¹²^, ¹³), microfluidic процессов (для включения выключения клапаны регулирования потока¹⁴^,¹⁵) и реологические модификаторы (для температуры перестраиваемый вязкости¹⁶). Наиболее часто расследование thermoresponsive, гидрогели на основе poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)¹⁷, хотя значительные (и растущего) работа велась также по поли (oligoethylene гликоль метакрилат) (POEGMA)²¹⁸ ^,и poly(vinylcaprolactam) (PVCL)¹⁹^,²⁰. POEGMA вызвал особый интерес последних, учитывая его ожидаемого улучшения биосовместимость²¹^,²²и его поведение СМЕШЕНИЯ снисходительный мелодию, в которой линейно предсказуемые смеси мономеров с различным числом Этилена оксид повторения единиц в их боковых цепей может изменить СМЕШЕНИЯ с ~ 20 ° C до > 90 ° C²^,²³. Однако каждый из этих полимеров готовится методом радикальной полимеризации и таким образом содержит углерод углеродных позвоночник, значительно ограничивая потенциальную полезность и переводимости таких полимеров в контексте биомедицинских приложений, в котором деградации (или по крайней мере потенциала в области разминирования путем почечной фильтрации) обычно это требование.

В ответ на это ограничение, мы недавно сообщили подробно о применении гидразоны химии (т.е., реакции между гидразида и альдегид функционализированных полимеров предварительно) подготовить разложению аналогов thermoresponsive гидрогели²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,^,²⁸²⁹. Быстрое и обратимой реакции между гидразида и альдегидными группами после смешивания прекурсоров функционализированных полимеров³⁰ позволяет как гелеобразования в situ (включение снисходительный инъекции этих материалов без необходимости хирургического Имплантация или любой тип внешних полимеризации стимула как УФ облучения или химическое инициирование) а также гидролизного деградации сети со скоростью, контролируемых химии и плотности сшивки сайтов. Кроме того поддерживая молекулярная масса предварительно полимеров, используемых для подготовки гидрогели ниже предела почечной фильтрации, гидрогели, сделанные с помощью этого подхода ухудшить обратно в олигомерных прекурсоров полимеров, которые могут быть очищены от тела²⁵ ^,²⁷^,²⁸. В сочетании с низкой цитотоксичности и ответ низкой воспалительных тканей, вызванных эти материалы по²⁵^,^,²⁶²⁷, этот подход обеспечивает потенциально переводимые метод для использования thermoresponsive смарт-гидрогелей в медицине, особенно если хорошо контролируемых разложению аналогов таких гидрогелей на всех масштабах длины (основная, микро и нано) могут быть сфабрикованы.

В этом протоколе мы описываем методы для изготовления синтетических thermoresponsive предварительно функционализированных с контролируемой числом гидразида и альдегидными группами а также методы для применения этих полимеров для создания гидрогели с четко определенными размерами на полимеры различные длины шкалы. В частности, эта рукопись описывает четыре различные подходы, мы разработали для управления смешивания реактивной гидразида и альдегид функционализированных полимеров до и таким образом создать thermoresponsive гидрогеля сетей с четкой геометрии и морфологии:

Для создания разложению массовых гидрогели с определенными размерами, стратегия шаблонов описано в которой предварительно полимеров загружаются в отдельный баррелей двойной баррель шприц на его выходе с статический смеситель и впоследствии коэкструдированные в силиконовые формы с желаемой гидрогеля форма и размеры²¹^,²⁷ (рис. 1).

Рисунок 1 : Схема формирования массовых гидрогеля. Гидразида и решения альдегид функционализированных полимеров (в воде или водный буфера) загружаются в отдельный баррелей двойным стволом шприца и затем коэкструдированные через статический смеситель в цилиндрических силиконовые формы. Быстрый в situ гелеобразования после смешивания форм гидразоны высокоструктурированные гидрогель, который является свободно стоящая (после удаления прессформы) в течение нескольких секунд до минут в зависимости от концентрации и функциональной группы плотность прекурсоров полимеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Чтобы создать разложению гель частиц микрон-масштабе, реактивной микрофлюидика метод описан в какой прекурсор полимера решения являются одновременно смешиваются и эмульсии с помощью мягкой литография шаблонного microfluidic чип дизайн, что позволяет образование капель смешанных реактивный полимерной, что впоследствии гель в situ в форме геля микрочастицы с размерами шаблонного³¹^,эмульсии (рис. 2)³².

Рисунок 2 : Схема формирования микрочастица гель через реактивной микрофлюидика. (A, B) Шприцевой насос в отдельные водоемы, которые связаны по течению через серию Зиг заг каналы, предназначенные для создания градиента давления, предотвращения обратного потока подпитывают гидразида и решения альдегид функционализированных полимеров (в воде или водный буфера). Полимеров затем смешивают непосредственно перед быть стриженый парафиновое масло течет с обеих сторон (также обусловлен шприцевый насос) и пропускается через сопло, результате упором потока производства водных капель (раствор полимера) в фазе непрерывной Парафин нефтяной (см. п. (B) для иллюстрации области сопла и процесс формирования капли). Вводы для масла еще два парафин расположены после насадки для дальнейшего отдельные капельки в коллекции канала для полной гелеобразования до удаления частиц от ламинарного потока, после чего полученный микрокарпускулярные гели являются собранные в магнитно перемешивают стакан; (C) картина процесса формирования капли на насадку (Обратите внимание, что полимер гидразида помечается как синий, чтобы проиллюстрировать смешивания)

Для создания разложению гель частиц на наноуровне, термически управляемый реактивный самостоятельной сборки описан метод в котором решение одного из реактивной прекурсоров полимеров («семян» полимерные) нагревается выше его СМЕШЕНИЯ сформировать стабильное nanoaggregate, что Впоследствии высокоструктурированные путем добавления дополнительных реактивной прекурсор полимера («сшивки» полимерные); результате nanogel высокоструктурированные гидразоны имеет размер шаблонного непосредственно по nanoaggregate (рис. 3)²⁸.

Рисунок 3 : Схема формирования nanogel через термически управляемый реактивный самосборки. Водный раствор, содержащий гидразид функционализированных полимеров (thermoresponsive) нагревается выше его низкую температуру критические решения для создания стабильной uncrosslinked nanoaggregate. После, альдегид функционализированных полимеров добавляется crosslink nanoaggregate через образование гидразонов Бонд и таким образом стабилизировать nanogel частиц при охлаждении ниже СМЕШЕНИЯ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Чтобы создать разложению нановолокон, описана методика реактивной electrospinning, в котором двойным стволом шприц с статический смеситель на его выходе (как используется для приготовления сыпучих гидрогели) прилагается к стандартной electrospinning платформы (Рисунок 4 )³³.

Рисунок 4 : Схема формирования нановолокно гидрогеля через реактивной electrospinning. Двойным стволом шприца с статический смеситель (загружается как описано для сыпучих гидрогели, но включая также часть высокой молекулярной массой poly(ethylene oxide) как помощь electrospinning) монтируется на шприцевый насос, с иглой в конце шприца подключен для высокого напряжения питания. Гидразоны сшивки происходит во время волокна спиннинг процесс, так что когда поток хитов коллектора (алюминиевой фольги или вращающегося диска алюминия) морфология nanofibrous поддерживается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Применение таких методов для создания сетей разложению смарт гидрогеля продемонстрировал в настоящем Протоколе, с помощью PNIPAM или POEGMA как полимер интерес; Однако, описал основные подходы могут быть переведены на любой водорастворимый полимер, хотя и с соответствующей корректировке для вязкости и (в случае из самостоятельной сборки nanogel изготовления) стабильность предварительно полимера в формировании семя nanoaggregate.

Protocol

1. синтез гидразид функционализированных полимеров Примечание: Следующие конкретные рецепт предоставляется для PNIPAM-подражательный thermoresponsive POEGMA прекурсор полимера (10PO) с 30% мол гидразида функционализации. PNIPAM и POEGMA прекурсоров полимеров с различными этап перехода температур может быть подготовлен с использованием этой же общий метод, но изменить тип и соотношение основных мономеров используются (см. раздел 1.2 для модификации для различных POEGMA полимеров)21 , 25 , 27. Весят из 37 мг 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe, инициатор), 3.1 g диэтиленгликоль гликоль метакрилат (M(EO)2мА), 0,9 г метакрилат олигоэтиленгликоля (OEGMA475, n 475 г/моль = 7-8 этилена оксида повторения единиц), 523 мкл Акриловая кислота (AA, сомономерами) и 7,5 мкл thiolglycolic кислоты (TGA, агент передачи цепи) во флаконе сцинтилляционные стекла 20 мл. Для PO0 (комнатной температуры стеклования POEGMA) используйте 4.0 g M(EO)2мА (не OEGMA475). Для PO100 (без перехода температуры POEGMA) используйте 4.0 g OEGMA475 (не M(EO)2мА).Примечание: Промежуточная фаза перехода температуры может быть достигнуто на основе использования промежуточных смеси M(EO)2мА и OEGMA475, согласно Лутц и др. 23 Растворите все реагенты в диоксан (5 мл/г всего мономера) в круглой нижней колбе с одним или несколькими шеи. Очистите реакции с потоке азота (класса UHP) за 30 мин. После удаления, место колбу в предварительно нагретой масляной ванне, на уровне 75 ° C для 4 h под азота и помешивая магнитной 400 об/мин. После 4 ч удалите растворителя, с помощью роторный испаритель, равным 50 ° C и 200 об/мин. Растворите полученный полимер продукт в 150 мл деионизованной воды. Добавить адипиновой кислоты dihydrizide (АДГ) на пятикратное превышение Молярная количество остатков AA, включены в полимера (в этом примере, AA состоит из 29 моль % единиц мономера в полимерах, производится, согласно кондуктометрические титрования). Отрегулируйте пэ-аш раствор для рН 4,75 с использованием 0,1 М HCl. После стабилизации рН, добавить N-(3-dimethylaminopropyl) -N’-ethylcarbodiimide (EDC) в 5 раз Молярная превышение на номер AA остатков настоящее). Поддерживать реакции рН 4,75 с добавлением каплям 0,1 М HCl более 4 ч. Оставьте реакция на перемешивать всю ночь. Налейте раствор продукта в три пробирки длиной диализа ~ 30 см (3500 да молекулярный вес отсечения, 1 дюйма толщиной), используя воронку для сведения к минимуму утечки. Использовать пинч зажим, чтобы закрыть в нижней части трубки до заполнения путем складывания небольшой (~ 2 см) сегмент трубки для улучшения целостности зажим; повторить в верхней (нажав удалить пузырьки воздуха) при заполнении завершения. Место трубы внутри 100-кратного избыточный объем деионизированной воды и оставить по крайней мере 6 часов, полностью заменяя воду более шести циклов диализа для достижения желаемой чистоты. Lyophilize dialyzed образец для получения окончательного сушеные полимерный продукт. 2. синтез альдегид функционализированных полимеров Синтез альдегид прекурсоров мономер метакрилата N-(2,2-Dimethoxyethyl) (DMEMA) Место 200 мл раствора 20% w/v NaOH в 500 мл 3 шеи раунд нижней колбе. Cool решение в ледяной ванне и поддерживать температуру 0 ° c со льдом во время реакции. Добавьте 50 мл aminoacetyl альдегид диметил ацеталя охлажденного раствора NaOH. Добавить в 0,1 г темп ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-ил) oxyl) и перемешать в 400 об/мин, с использованием магнитной перемешать бар до тех пор, пока полностью растворяется темп. Добавление 48 мл хлорида methacryloyl каплям с помощью бюретки более 2 ч. После 2 ч покрывают реакционный сосуд с алюминиевой фольгой и оставить на перемешивать всю ночь. Экстракт продукта путем добавления продукт реакции в 75 мл петролейный эфир в воронку разделения 1 Л, тряски, дегазации и отбрасывая верхний слой. Повторите шаг 2.1.7 три раза путем добавления нижний слой продукта от каждого шага извлечения как сырье для следующего цикла добычи. Удаление окончательный нижний слой продукта и передачи 100 мл стакан. Добавить ~ 5 г сульфата магния (Mg2т4) в стакан с мономера до «Снежный шар» наблюдается эффект. Фильтрация через 100 мл Buchner воронка для удаления мг2т4. Промойте стакан дважды с ~ 75 мл трет бутилметиловый эфир, наливание полоскания раствор через воронку каждый раз. Передача продукта 500 мл раунд нижней колбе и испарения растворителя, используя роторный испаритель при комнатной температуре 200 RPM для сбора конечного продукта. Синтез альдегид функционализированных полимеровПримечание: Следующие конкретные рецепт предоставляется для PNIPAM-подражательный POEGMA прекурсор полимера (10PO) с 30% мол альдегид функционализации. PNIPAM и POEGMA прекурсоров полимеров с различными этап перехода температур может быть подготовлен с использованием того же общего метода, но изменить тип и соотношение основных мономеров используются (см. раздел 1.2 для модификации для различных POEGMA полимеров)21 , 25 , 27. Весят из 37 мг 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 3.10 g диэтиленгликоль гликоль метакрилат M(EO)2мА, 0,1 г oligo ЭГ метакрилат (OEGMA475, 475 г/моль, n = 7-8 этилена оксида повторения единиц), 1,30 g N-(2,2- Акриламид dimethoxyethyl) (DMEMA) и 7,5 мкл thiolglycolic кислоты (TGA) во флаконе сцинтилляционные стекла 20 мл. Для PO0 (комнатной температуры стеклования POEGMA) используйте 4.0 g M(EO)2мА (не OEGMA475). Для PO100 (без перехода температуры POEGMA) используйте 4.0 g OEGMA475 (не M(EO)2мА).Примечание: Промежуточная фаза перехода температур может быть достигнуто на основе использования промежуточных смеси M(EO)2мА и OEGMA475, согласно Лутц и др. 23 Растворите все реагенты в диоксан (5 мл/г всего мономера) в круглой нижней колбе с одним или несколькими шеи. Очистите реакции с потоке азота (класса UHP) за 30 мин. После того, как очищенные, место колбу в предварительно нагретой масляной ванне поддерживается на 75 ° C для 4 h под азота и помешивая магнитной 400 об/мин. После 4 ч удалите растворителя, с помощью роторный испаритель, равным 50 ° C и 200 об/мин. Распустить полученный полимер продукт в 100 мл дейонизированной H2O. Добавьте 50 мл 1 M HCl в растворенного раствор и перемешать под магнитной перемешивания (400 об/мин) за 24 ч до полностью гидролизуют ацеталя функции DMEMA. После завершения реакции передача раствор полимера в трубы диализа, в соответствии с шагом 1.13. Lyophilize dialyzed образец для получения окончательного сушеные полимерный продукт. 3. Изготовление гидразоны Crosslinked массовых гидрогели Растворите гидразида и альдегид функционализированных полимеров отдельно в 10 мм-фосфатный буфер (PBS) или любой желаемой водный буфера, для создания решения желаемой концентрации.Примечание: Масса концентрации от 5-40 wt % обычно используются, с гелеобразования при более низких концентрациях, возможно, если выше фракций функциональной группы присутствуют на полимеры. С помощью одного барреля шприца для передачи решения, загрузить каждое решение (~ 1 мл) прекурсоров в отдельные бочки двойным стволом шприца (2,5 мл объем, соотношение 1:1 шприц) придает статический смеситель (1,5″ длина) и (необязательно) шприца (обычно 18 G, 1.5″ длина для исследования in vitro) и (при необходимости) шприца (обычно 18 G, 1,5″ длина для исследования in vitro). Подготовка формы нужной толщины, формы и диаметра пробивки отверстий в силиконовый резиновый лист.Примечание: В типичном эксперименте, набор стандартных удар используется ударить 7 мм диаметр цилиндрических отверстие внутри 1/16″ толстые силиконовые резины лист (общий объем водохранилища ~ 300 мкл). Гора, силиконовые формы на микроскопе стандартного стекла слайда таким образом, чтобы отверстия кулаками в плесень полностью опираются на стекло. 0,1 М HCl мыть стекла рекомендуется но не требуется до монтажа силиконовые формы. Совместное Выдавить содержимое шприца двойным стволом через статический смеситель, чтобы полностью заполнить (или слегка переполнения, с мениска в верхней) силиконовые формы.Примечание: Несколько образцов может быть подготовлен в течение одного экструзии образца при условии время гелеобразования на тот же порядок величины или больше, чем общее время, необходимое для заполнения нескольких форм. Место другой стандартный стекло микроскопа поверх плесень и ждать гелеобразования для завершения.Примечание: Стандартные рецепты, описанные в разделе гель синтез в < 1 минута; медленнее гелеобразования раз (и, таким образом, больше требуется ждать раз) наблюдаются при более низких плотностей функциональной группы, более низкие концентрации полимера и/или выше доли475 OEGMA относительно M(EO)2мА (для POEGMA гидрогелей). Удаление верхней микроскопа и лопаточкой подтолкнуть гидрогеля от плесени силиконовые резины. Поднимите плесень от нижней микроскопа для восстановления гидрогели для дальнейшего тестирования. 4. Изготовление гидразоны сшитый гель микрочастиц Изготовление чип Microfluidic Обезвоживает кремниевой пластины (D = 76,2 мм, 380 мкм толщина, P-легированный, ориентация) при нагревании на конфорку на 200 ° C за 5 мин. Центр пластины на спин coater и пальто, ~ 100 мкм толстый слой Су-8 100 фоторезиста, применяя ~ 7 мл Су-8 сопротивляться, наращивает спин скорость до 3000 об/мин со скоростью 500 об/мин/s, а затем удерживая скорость 3000 об/мин за 30 секунд. Предварительно испечь покрытие при 65 ° C для 10 мин и затем софт выпекать покрытие при 95 ° C за 30 мин. Печатайте photomask на прозрачности с microfluidic шаблон, определенный на рисунке 2A, таким образом, чтобы прозрачные разделы являются желаемый узор полимеризованной фоторезиста слоя. Вставки в маску выравниватель фоторезиста покрытием кремниевой пластины и photomask и разоблачить вафельные 365 Нм света для 95 s (6.5 W мощность воздействия). Выпекать узорной вафельные для 10 мин при 95 ° C, сначала, поместив его на конфорку при 65 ° C и впоследствии Отопление плитой до 95 ° C 10 ° C/мин. Удалите пластины с плитой и место в 500 мл стакан, содержащие 100 мл Су-8 разработчик для по крайней мере 10 мин, закрученной вафельные медленно в решении во всем для удаления фоторезиста не подвергаются. После 10 минут промойте узорной вафельные изопропанолом и высушить воздухом. Храните узорной пластин в прохладном, сухом среде вдали от света, когда не в пользе для формования мягких литографии реплики. Место узорной microfluidic плесень в чашку Петри. Положение ~ 10 мм длины трубки силиконовые 13 Л/С на впуски и выпуски чипа. Налить ~ 10 мл поли (диметил силоксановых) (PDMS; готовят путем смешивания силиконового эластомера базы и силиконовые эластомера отверждения агента в соотношении 10:1) на вершине чип, тщательно избегая включения каких-либо PDMS внутри размещены Силиконовая трубка. Место на Петри блюдо в вакуумной камере ~ 10 мин для удаления воздушных пузырей, упорствуя в и вокруг узорной структуры в процессе отверждения. Вылечить PDMS, поместив Петри, содержащий узорной плесени и неотвержденных PDMS на конфорку на 85 ° C для 2-3 ч. Осторожно отделите вылечить PDMS из узорной кремниевой пластины подвергать мягкой литографических узорной PDMS реплике microfluidic плесени. Место узорной PDMS и стеклянное скольжение вверх вниз в мощных плазменных очиститель с подачи воздуха. Применение плазмы на 200 mTorr и 45 W для 90 s облигаций PDMS слайд стекла и создать окончательный microfluidic чип. Синтез гель микрочастиц Подготовьте гидразид функционализированных PNIPAM (PNIPAM-Hzd), растворяют в 20 мл безводного этилового спирта NIPAM (4.5 g), акриловой кислоты (0,5 г – 15 моль % всего мономера), тиогликолевой кислоты (TGA, 80 мкл) и 2,2-azobisisobutyric кислоты диметиловый эфир (AIBME, 0,056 g) и Впоследствии после шаги 1.4-1.14 для завершения синтеза, хотя изменение температуры реакции до 56 ° C на шаге 1.5. Подготовьте альдегид функционализированных PNIPAM (PNIPAM-нос), растворяют NIPAM (4 g), N-(2,2-dimethoxyethyl) метакрилата (DMEMA, 0,95 g – 13.4 моль % всего мономера), тиогликолевой кислоты (TGA, 80 мкл) и 2,2-azobisisobutyric кислоты диметиловый эфир (AIBME, 0,056 g) в 20 Мл этанола и впоследствии после 2.2.4-2.2.10 шаги для завершения синтеза, хотя изменение температуры реакции до 56 ° C в шаге 2.2.5. Растворяют PNIPAM-Hzd и PNIPAM-Ламед 6 wt % в деионизированной воды и нагрузки в отдельный стандарт 5 мл-шприцы. Растворить 1 wt % неионогенных поверхностно-активных веществ (например, диапазон 80) в тяжелых парафинового масла и загрузите решение в стандартных 60 мл шприц. Подключите два прекурсор полимера решение шприцы индивидуально к два отдельных полимерных подводящих каналов на microfluidic чип и решение нефти парафина нефти впускной канал на чипе microfluidic через 1/32″ ID силиконовые трубки (~ 30 см Длина на входе, ~ 45 см Длина на выходе). С помощью двух отдельных инфузионные насосы шприца (один на нефть вверх по течению, один для масла, добавить после сопла), поставлять нефть в чип со скоростью потока между 1,1 мл/ч и 5,5 мл/ч без запуска потока полимера премьер чип и обеспечить чип дефектов и Оперативная (обычно поддерживается в течение 30 мин). Используя отдельный инфузионный шприцевый насос, доставить каждое из решений водной полимерной чип 0,03 мл/ч со скоростью потока. После первоначального периода стабилизации для обеспечения потока достижение равновесного уровня и единообразных частицы образуются (30 мин.-1 ч) собирайте частицы в колбе магнитно перемешивают круглым дном. Собирать частицы до тех пор, пока все масло употреблять (12-55 h, в зависимости от потока). Остановить шприц насосов и, при желании, сразу качать воду вместо растворов полимеров прекурсоров через чип для очистки. Однако учитывая быстрое на месте гелеобразования этих материалов, когда поток остановлен, рекомендуется использовать новый чип для каждого отдельного эксперимента. Выключить магнитная перемешивании и позволяют гель микрочастицы урегулировать. Декант у всех доступных парафинового масла с помощью пипетки. Чтобы удалить оставшиеся парафинового масла, Промойте гель микрочастицы пентан (применяется в объеме 10 мл на каждые 0.5 мл микрочастица тома), энергично перемешивают эмульсия для ~ 1 минута, позволяют гель микрочастицы вновь поселиться на ~ 1-2 часа и сцеживаться выкл остаточные органические фазы с помощью пипетки. Повторите по крайней мере 5 раз обеспечить полное парафин нефти удаления. Ресуспензируйте гель микрочастиц в 10 мл деионизированной воды внутри флакона сцинтилляционные стекла 20 мл и очистить флакона с азотом на ночь, чтобы удалить любые остаточные пентан. 5. Изготовление гидразоны сшитого Nanogels Распустить акций решения PNIPAM-Hzd (1 w/v%) и PNIPAM-нос (1 w/v%) в деионизированной воде. Подготовьте PNIPAM-Hzd и PNIPAM-нос, как описано в разделах 4.2.1 и 4.2.2, соответственно. Тепло Алиготе 5 мл PNIPAM-Hzd акций решения до 70˚C с помощью масляной ванне под магнитной перемешивания (350 об/мин) внутри флакона сцинтилляционные стекла 20 мл.Примечание: Решение должно стать непрозрачным (т.е. температура превышает нижний критический решения температуры PNIPAM-Hzd), но не видимый преципитат должны быть сформированы. Добавьте 0,25 мл Алиготе PNIPAM-нос (5-20 wt % от массы PNIPAM-Hzd присутствует в семени решения) drop-wise в подогреваемый PNIPAM-Hzd раствор в течение 5-10 сек. Продолжать смешивания которые решение в сцинтилляционном флаконы для дополнительных 15 минут, после которого удалить образец из масляной ванне и позволяют продукт на ночь остыть до комнатной температуры. Dialyze результате nanogels над 6 x 6 час циклы (с помощью диализа мембраной 3500 MWCO кДа) против деионизованной водой, чтобы удалить любые номера из сшитого полимера. При желании, lyophilize для хранения. 6. Изготовление гидразоны Crosslinked Nanofibers Подготовить гидразид функционализированных POEGMA (POEGMA-Hzd), растворяя 37 мг диметил 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), метакрилат 4.0 g олигоэтиленгликоля (OEGMA475, 475 г/моль, n = 7-8 этилена оксида повторения единиц) и 0,25 г акриловой кислоты (AA) в 20 мл диоксане и следующие шаги 1.3-1.14 для завершения синтеза. Подготовьте альдегид функционализированных POEGMA (POEGMA-нос), растворяют 50 мг диметил 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), метакрилат олигоэтиленгликоля 4.0 g (OEGMA475, 475 г/моль, n = 7-8 этилена оксида повторения единиц) и 0,60 g N-(2,2- метакрилат dimethoxyethyl) (DMEMA) в 20 мл диоксане и следующие шаги 2.2.3-2.2.10 для завершения синтеза. Растворяют POEGMA-Hzd (15 wt %) и POEGMA-нос (15 wt %) в отдельных деионизированной воды решений. Распустить поли (этиленоксид) (ПЭО, Мw= 600 x 103 g/mol, 5 wt %) в деионизированной воде. Смешайте 1 мл раствора ПЭО с каждой реактивной POEGMA раствором, приготовленным на шаге 6.3 для создания окончательного прекурсоров решения 7,5 wt % POEGMA прекурсор полимера и 2,5 wt % ПЭО. Загрузить два решения в отдельный баррелей же шприц двойной ствол, описанных в разделе 3 (в том числе 1,5″ статический смеситель) и смонтировать двойным стволом шприц на инфузионный шприцевый насос. Прикрепите статический смеситель и тупой наконечник 18G иглы шприца двойной баррель. Подключение источника высокого напряжения питания к тупой кончик иглы, основаны на сборщике.Примечание: Коллекционеры состоять либо из квадрат 10 x 10 мм алюминиевой фольги или ~ 10 мм диаметр алюминиевый диск, спиннинг в размере 200 об/мин, как монтируется перпендикулярно к иглу на расстоянии 10 см от конца иглы. Запустите шприцевый насос в размере 0,48 мл/ч и, одновременно, включите высокого напряжения 8,5 кв для выполнения electrospinning и создания нановолокон. Продолжать electrospinning нужным сделать подмостей различной толщины или до тех пор, пока исчерпаны входе решения. Чтобы удалить помощи electrospinning ПЭО, Замочите собранные подмости для 24 h в деионизированной воде.

Representative Results

Массовая гидрогели, штампованный из шприца двойным стволом в силиконовые формы соответствуют размеры формы и стать самостоятельным после удаления плесени; Гелеобразование обычно происходит от секунд до минут, следующие соэкструзии в зависимости от полимера прекурсоров используются. Типичная характеристика через опухоль (измеряется распределяемому использование insert культуры клеток легко удалить гидрогеля из раствора, отек), thermoresponsivity (измерены используя ту же технику, но Велоспорт выше температуры инкубации и ниже температуры стеклования фазы) деградации (измеренных с использованием же технику, но течение более длительных периодов времени) и при сдвиге или модуль сжатия (измеряется с помощью 2 мм толщиной 7 мм, а диаметр формованных образцов) демонстрирует перестройки Гидрогель ответов в зависимости от химического состава прекурсор полимера (в частности, для POEGMA, соотношение коротких длинная цепь OEGMA мономеры используются для подготовки Гидрогель), Мольная доля функциональных групп на полимеры прекурсоров и концентрации тех прекурсоров полимеров (рис. 5)27. Микрофлюидика приводит к образованию четко гель микрочастиц на шкале размер 25-100 мкм, с контролируемым размера на основе скорости потока нефти и/или комбинированных водной полимерной фазы (рис. 6A)31. Горячей сцене оптической микроскопии подтверждает, что гель микрочастицы поддерживать thermoresponsive характер массовых гидрогели, показаны реверсивные температур зависимая опухоль deswelling с только небольшой гистерезиса на цикл 1 (объясняется формирования необратимых водородных связей между соседними амидными группами в свернутом состоянии34) в соответствии с этим наблюдается в массовых PNIPAM гидрогели (Рисунок 6B)32. Кроме того гель микрочастицы обратно к их олигомерных прекурсоров со временем ухудшаться, позволяя почечного клиренса (рис. 6 c)32. Самосборки обусловлен nanoaggregation гидразид функционализированных полимеров PNIPAM в растворе с подогревом, следуют сшивки с PNIPAM альдегид функционализированных полимеров приводит к весьма монодисперсных nanogels (полиизопрена < 0.1) на диапазон размеров 180-300 Нм, в зависимости от условий процесса используется (рисA)28. Nanogels сохранить типичные thermoresponsive поведение обычных свободно радикального сшитого PNIPAM nanogels, с более низких степеней тепловой deswelling наблюдали как более сшивки полимера был добавлен (рис. 7Б). Nanogels может быть лиофилизированные и редиспергируемые без изменения размера частиц (рис. 7C) и деградируют с течением времени через гидролиз повторно сформировать олигомерных прекурсоров полимеров, используемых для разработки nanogels (рис. 7D). Реактивной electrospinning создает nanofibrous гидрогеля структуру (рис. 8A), с диаметрами нановолокно порядка ~ 300 Нм достижимо без видимых electrosprayed частицы представляют33. Замачивания POEGMA на основе нановолокон в воде приводит к быстрому гидратации (примерно двух порядков быстрее, чем с массовых гель того же состава, Рисунок 8B), но сохраняет морфология nanofibrous более 8-10 недель до гидролитическая деградации в физиологических условиях; быстрее деградация наблюдается в катализируемой кислоты средах, как ожидалось, из-за возможность возникновения кислоты катализированное гидразоны Бонд деградации (рис. 8C). Nanofibrous структуры являются также механически надежные в сухой и опухшие государств через несколько циклов, позволяя управляемость и повторяющихся напрягаясь (рис. 8D). Рисунок 5 : Свойства in situ -гелеобразующего сыпучие разложению thermoresponsive гидрогелей. (A) представитель POEGMA гель микроструктур сети и массовых гидрогеля изображения с соответствующим гелеобразования раз как функция включения моль % OEGMA475 в полимерах прекурсоров; (B-C) Хранения модуль PO100 гидрогелей различной концентрации полимера прекурсоров (B) и (C) моль % функциональной группы включения за прекурсор полимера; (D-F) Физико свойства POEGMA гидрогелей как функция OEGMA475 моль % включения: (D) хранения модуль упругости (E) деградации профиль в 1 М HCl и (F) объем фазы перехода температуры в ответ на температуры изменения в диапазоне 20-60 ° C. Все планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение n = 4 измерений. Адаптировано из ссылки27 с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 : Свойства микрочастиц разложению гель от реактивной микрофлюидика. (A) влияние скорости потока нефти парафина на размер микрочастица (очищенный) геля в воде; (B) Thermoresponsivity очищенный гель микрочастиц в воде после одного цикла теплового выше и ниже температуры стеклования фазы тома; (C) Visual оценки (Фото) и гель пропитывание хроматографии следы (граф) подтверждающий деградации гель микрочастиц обратно в их прекурсоров полимерных компонентов (здесь, в HCl 1 M для содействия ускоренной деградации изображения на временной шкале); шкалы бар = 100 µm. адаптированный ссылки32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7 : Свойства разложению nanogels от реактивной самосборки. (A) частиц размер распределения nanogels, приготовленные с различными альдегид: гидразид полимер массовые коэффициенты от динамического рассеяния света (врезные: передачи электронная микрофотография подтверждающие сферических характер nanogels); (B) Thermosensitivity самостоятельно собранных частиц как функция массового соотношения между альдегид: гидразид полимер используется для подготовки nanogels (от динамического рассеяния света), с погрешностей, представляющий стандартное отклонение n = 4 реплицирует; (C) Visual подтверждение отсутствия nanogel агрегации пред и пост лиофилизация; (D) визуального подтверждения кислоты катализированное деградации nanogels (здесь в HCl 1 M для обеспечения согласованности с другими исследованиями выше); (E) гель пропитывание хроматограф следы продуктов разложения nanogel указанием их сходство с гидразида и прекурсоров альдегид функционализированных полимеров. Адаптирована с разрешения ссылки28. Авторское право 2015, американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 8 : Свойства разложению nanofibers из реактивной electrospinning. (A) растровая электронная микроскопия изображения nanofibers в сухом государства (слева), половина смоченной в воде (средний, тонкая пленка) и полностью замачивают в воде на ночь (правый, густые леса); (B) набухания гидрогеля nanofibrous (красный) относительно массовых гидрогеля (синий) того же состава, с погрешностей, представляющий стандартное отклонение n = 4 реплицирует; (C) сканирование электронной микроскопии и (вставка) визуальные образы отслеживания кислоты катализированное деградации nanofibers в 1 M HCl; (D) при растяжении Велоспорт сухой (80 циклов, 20% Удлинение/цикл) и опухшие (325 циклов, 10% удлинение/цикл в 10 мм PBS) electrospun nanofibrous гидрогелей. Рисунок изменен от ведения33 и воспроизводится с разрешения от Королевского общества химии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Мы успешно применяется все эти методы изготовления к нескольким полимерных систем с использованием только незначительные вариации из методов, описанных в деталях выше для PNIPAM и POEGMA; Однако пользователи этих протоколов должны быть осведомлены о потенциальных проблемах, которые могут возникнуть при замене других полимеров в эти процессы. В частности увеличение вязкости полимеров прекурсоров может негативно сказаться технологичность (особенно в методе microfluidic), а также эффективность смешивания двух прекурсоров полимеров. Кроме того необходимо контролировать время гелеобразования полимеров по курсу зависит от морфологии, направлены для того, чтобы избежать преждевременной гелеобразования, которая служит, чтобы препятствовать потока или предотвращения образующиеся предварительно полимеров, необходимо сформировать требуемый однородный гель структуры. Ниже описаны конкретные ограничения каждой стратегии, а также подходы, которые мы использовали, чтобы адаптировать эти подходы к решению таких ограничений на каждой шкале длина изготовления.

Сыпучие гидрогели через двойным стволом шприц ко-экструзия
Время гелеобразования является ключевым переменная управления для обеспечения эффективности метода шприц двойным стволом для формирования массовых гидрогели. Полимеры, которые гель слишком быстро после контакта ( 5 s являются предпочтительными (хотя не обязательно) для использования этого метода; Это особенно важно, если реплицировать гидрогели отбрасываются для физического или механического анализ, чтобы убедиться, что каждый гидрогеля литой имеет тот же состав. Время гелеобразования могут быть легко изменены путем изменения плотности реактивной функциональных групп на одном или прекурсоров полимеров (Нижняя функциональной группы плотности приводит к медленнее гелеобразование) или изменения концентрации полимеров прекурсоров используется для формирования (гель снижение концентрации, ведущих к медленнее гелеобразование)²¹. Попеременно заменив группе (более реактивный) альдегид (менее реактивной) группы кетонов как электрофил в паре гелеобразующего значительно уменьшает время гелеобразования без значительного изменения состава результате Гидрогель³⁵; Полимеры, приготовленные смеси альдегид и кетон мономерных прекурсоров может использоваться для настройки время гелеобразования по желанию без изменения концентрации прекурсоров полимеров, используемых (и, таким образом, массовые процент твердых веществ в результате гель сформирован).

Мы хотели бы также отметить, что первая ролях гидрогеля не всегда имеют те же свойства, как последующие гидрогели бросили, наблюдения, приписываемых незначительные различия в курс, при котором содержимое двух бочек действительно достичь статический смеситель. В результате, мы обычно премьер двойным стволом шприц путем выдавливания небольшой (< 0,3 мл) часть геля до начала процесса литья для сведения к минимуму такой изменчивости. Наконец хотя не обычно проблематично при использовании олигомерных предварительно синтетических полимеров, вязкость одного или нескольких решений прекурсор полимера может создать проблему в контексте этой техники, как с точки зрения облегчения потока с помощью простой пальца депрессии а также поощрение эффективного смешивания в статический смеситель. Однако, немного удивительно, даже прекурсор полимера решения с резко различной вязкости по-прежнему образуют относительно однородных гидрогели, используя статический смеситель вложения, описанные в списке частей (например, PNIPAM с высокой молекулярной Вес углеводов²⁶), предполагая, что озабоченности по поводу неэффективного смешивания в результате неправильного соответствует вязкости не может быть значительным по крайней мере в массовых масштабах. При необходимости, использование шприцевый насос (вместо пальца) диск потока и/или использование больших иглы на выходе может помочь преодолеть проблемы, связанные с extrudability в этих системах.

Микромасштабной гидрогели через реактивной микрофлюидика
Ключевым шагом, связанные с подходом микрофлюидика для изготовления микрочастица гель является грунтовка микрофлюидика чип с двух полимеров. Если полимеры поставляются с различные давления или с разной скоростью в чип, дифференциального давления может управлять обратного потока раствора одной прекурсор полимера в водохранилище (или по крайней мере к водохранилище) других прекурсор полимера. Это приводит к гелеобразования, вверх по течению от образование частиц, эффективно блокируют поток и таким образом требует удаления стружки. Мучительный путь запечатлел между каждой водохранилище и точкой смешивания создает значительное сопротивление обратного потока; Однако даже обученный оператор будет иногда гель чип, прежде чем достигается стабильный поток режима. Основываясь на нашем опыте, между 1-2 мин обычно необходима для стабилизации потоков после начала формирования капли (который со временем относительно полидисперсных гель микрочастицы производятся); Если проблем не наблюдается в течение первых 5-10 минут работы, вполне вероятно, что несколько часов непрерывной монодисперсных частиц производства может быть достигнуто. Использование прекурсоров полимеры с относительно хорошо подобранная вязкости, а также не мгновенное гелеобразования раз (по крайней мере > 15 s более предпочтительным) значительно помогает избежать таких проблем и содействия формированию стабильных потоков.

Обратите внимание, что различные расхода, начиная от 0,01-0,1 мл/ч в водной фазе и 1.1-5,5 мл/ч в масляной фазы были протестированы с использованием этой микросхеме, ведущих к изготовлению частиц на диапазон размеров ~ 25-100 мкм согласно сдвига, применяемых на поток упором Джанкшн; скорость потока приравнивается к выше сдвига и таким образом мелкие частицы сформирован³¹^,³². Различные скорости потока нефти сохраняя общий водный поток скорость низкая (~0.03 мл/ч, как цитируется в протоколе) был найден наиболее эффективно контролировать размер микрочастица гель без ущерба для жизни устройства или монодисперсность, оба из которых были наблюдается значительно уменьшить в высших конце ставок цитируется общий водный поток. Большие скорости потока нефти (> 5,5 мл/ч) для создания возможны мелкие частицы, но повышает риск отслоения чип (общие ограничения, столкнулись с плазмы стружечные PDMS microfluidic фишек). Склеивание стружки с использованием другого метода может позволить быстрее скорости потока и таким образом меньше гель микрочастица производства, стратегия, которую мы в настоящее время изучают. Уменьшение размера сопла может также помочь уменьшить размер микрочастицы, которые могут быть произведены, хотя и на повышенный риск преждевременного гелеобразования до образование частиц. Медленнее скорости потока, как правило, приводят к потока нестабильности и, таким образом, выше polydispersities и повышенный риск гелеобразования чип; Это ограничение можно преодолеть с помощью системы управления потоком многоканальный microfluidic, которая имеет большую стабильность и высокое разрешение, чем стандартный шприц насосы, используемые в настоящем Протоколе.

Выбор масла имеет решающее значение для успеха этого протокола, как тяжелее масла (благоприятные с точки зрения предотвращения гель микрочастица агломерация после сбора) привели к гораздо меньше последовательное образование частиц на насадку, чем свет силиконовое масло сообщалось в Протокол. Мы предполагаем, это сокращение воспроизводимость является результатом ниже последовательности шприц насосных тяжелее масла, приводит к более переменных сдвига в точке смешивания. Избегая гель микрочастица агрегации в колбу коллекции также был вызов, особенно сразу же при выходе из устройства microfluidic, в какой-то момент в situ гелеобразования был не полный и большое число доступных реактивной функциональных группы были доступны для формы мосты между сталкивающихся частиц в ванне коллекции. Эта задача решается: увеличение длины канала выхода на сам чип microfluidic, поддержание гель микрочастиц в ламинарного потока для более длительного периода времени, чтобы содействовать более полной гелеобразования; Добавление боковые каналы после сопла кормить больше нефти в чип и таким образом лучше отдельный гель микрочастиц в этом после смесительного канала не затрагивая сдвига поля на насадку, сам или уровень производства частиц; и добавление коллекции колбу избежать магнитный смеситель гель микрочастица седиментации и сохранить больше среднего разделение между соседними частицами. Хотя очень медленно гелеобразующего полимеров скорее всего будет улучшить стабильность устройства и свести к минимуму проблемы с грунтовки, такие системы также наблюдались значительно увеличить риск гель микрочастица агрегации, как большее число реактивной функциональных групп остается непрореагировавшего (и таким образом возможность формы межчастичных мосты) течение более длительного периода времени. Таким образом, время гелеобразования порядка 15-60 s, как представляется, оптимальным для этой техники: медленно достаточно, чтобы грунтовка, но достаточно быстро обеспечить наиболее реактивный функциональных групп потребляются до гель микрочастицы, выход канала ламинарного потока Колба коллекции.

Наконец удаление шаблонов нефти имеет важное значение для обеспечения что результирующая частицы поддерживать свойства смарт-предполагалось, основанные на состав предварительно добавлен полимеров и включить использование этих частиц в рамках биомедицинских. Пентан, мытье описанной процедуры был весьма эффективным в этой связи для общего гель микрочастица производства. Однако применение этого метода в рамках биомедицинских прямой (например, на чипе клеток инкапсуляция) потребует повторной оценки настоящего Протокола. Мы также изучили использование оливкового масла, предложил что более инертными нефти в контексте обращения клетки³⁶, как диспергаторов. Хотя образование частиц возможно, гель микрочастица населения были значительно больше полидисперсных чем может быть достигнуто с минеральным маслом, по крайней мере с текущей чип дизайн. Таким образом в то время как чип, как представляется, быть адаптированы к синтетического полимера и природный полимер гель микрочастица формирование³¹, изменение дизайна может потребоваться более широко использовать эту технику во всех возможных комбинаций материалов.

Наноразмерных гидрогели через реактивной самостоятельной сборки
Nanogels были сформированы с помощью очень широкий спектр обработки условий, в том числе различные концентрации полимера семян (0,5-2 wt %), различные соотношения crosslinking:seed полимеров (0,05-0,2), различные температуры (40-80 ° C), различные смешения (скорости 200-800 об/мин) и различные Отопление раз после добавления сшивателя полимера (2-60 мин)²⁸. С точки зрения концентрации наблюдаемые тенденции, как правило, как было бы предсказать, как более высокие концентрации Семенной полимера приводят к более nanogels и более высокие коэффициенты crosslinker:seed полимера приводят к nanogels с более высокой плотностью crosslink и таким образом снизить thermoresponsivities. Следует подчеркнуть, что увеличение семян полимер концентрация слишком высока в конечном итоге приводит к массовой агрегации в отличие от nanoaggregation, в соответствии с того, что наблюдается в процессе обычного свободных радикалов осадков для формирования thermoresponsive nanogels³. Короче Отопление раз также оказались благоприятными для формирования меньше и больше монодисперсных частиц. Мы предполагаем, что проведение nanoaggregate на более длительное время при температуре выше СМЕШЕНИЯ, одно или оба из полимеров прекурсоров увеличивает вероятность агрегации по nanogel столкновения, с повышенной гидрофобность гидразоны Бонд относительно либо прекурсоров альдегида или гидразида функциональных групп делая более вероятно, как увеличивается степень сшивки достичь этого агрегата. В конечном счете короче Отопление раз благоприятные с точки зрения процесса, как монодисперсных nanogel население может быть сформирован в качестве лишь 2 мин после добавления сшивателя полимера; 10 мин оказался дольше, который может постоянно производить монодисперсных nanogels позволяя для производства более высоко сшитого nanogels. Интересно, что метод удивительно чувствительны к смешивания, с почти идентичны размерам и распределением размера частиц в результате смешивания на разных скоростях или даже масштабирование процесса в больших объемах. Хотя первоначально удивлен этим результатом, он вероятно говорит основная роль термодинамики в регулировании nanogel производства.

Для достижения низкой polydispersities, коллоидной стабильности и степень гидратации nanoaggregate, как представляется, быть ключевых переменных. Например nanoaggregates, подготовлен с использованием более гидрофильные гидразид функционализированных полимеров как семя в отличие от менее гидрофильные альдегид функционализированных полимеров привести к nanogels с значительно более низкой polydispersities. Разница между температурой экспериментальной сборки и СМЕШЕНИЯ семян полимер также имеет решающее значение. Работает при температуре чуть выше семян полимер СМЕШЕНИЯ ((T-LCST) < 5 ° C) предлагает наибольшую вероятность формирования nanogel монодисперсных; работает также над СМЕШЕНИЯ создает более гидрофобных и рухнул nanoaggregates, что чаще всего совокупного и менее вероятно, чтобы crosslink, работая под результатами СМЕШЕНИЯ в сравнительно с некомпактными семян полимер, который не может быть эффективно или можно воспроизвести высокоструктурированные. Лучшее предсказание частиц монодисперсность, мы рекомендуем сначала сканирование УФ вид для измерения начала СМЕШЕНИЯ семян полимера и впоследствии выполнение самостоятельной сборки процесс при температуре 1-2 ° C выше этого СМЕШЕНИЯ.

Обратите внимание, что nanogels производится с помощью этого метода может лиофилизированный и редиспергируемые без каких-либо изменений в коллоидной стабильности, часто не представляется возможным для собственн-собранные структур и на наш взгляд, объясняется нашим методом стабилизации сшивки. Мы также ожидаем, что только полимерные семян должна быть thermoresponsive, для этот метод работы; Использование сшивки полимеров, которые либо не отвечают или реагировать на другие стимулы могут далее расширить конечной применимость этой техники. Наконец так как смешение двух полимеров реактивной прекурсоров, в этом случае пассивный, активный, время гелеобразования в отличие от гораздо менее важным с точки зрения управления процессом относительно изготовления других стратегий, описанных. Однако, даже в этой технике, сохраняя общее сшивки время < 30 мин желательно свести к минимуму риск агрегации частиц.

Nanofibrous гидрогелей через реактивной electrospinning
Управление время гелеобразования предварительно полимеров снова имеет важное значение для успеха гель нановолокно производства. В частности примерно соответствующие время пребывания прекурсоров полимеров в статический смеситель (контролируется путем изменения скорости потока раствора из шприца двойной ствол, а также длину и извилистость статический смеситель) с массовых гелеобразования время полимеров прекурсоров имеет важное значение как для сохранения spinnability, а также обеспечить эффективное сшивки закружилось волокон между иглой и коллекционер. Быстрее гелеобразования приводит к неэффективной Тейлор конуса развития и таким образом бедных spinnability, во время медленнее гелеобразования результаты в водном растворе вместо геля, ударяя коллектора, что приводит к распространению и конечной формирования тонкой пленки гель вместо нановолокон. Работа в резиденции раз чуть ниже время гелеобразования основная также были найдены быть эффективным (и действительно предпочтительнее снизить риск закупорки иглы) поскольку испарение воды как решение закрущен эффективно концентрирует прекурсоров полимеров в поток и таким образом ускоряет гелеобразования кинетики во время процесса прядения. В этом же ключе частотой выше иглы коллекционер расстояния (> 10 см) является в целом благоприятным в этот процесс, как короткие расстояния сократить время, необходимое для испарения воды и поэтому требуют более строгий контроль над отношения между время пребывания и времени гелеобразования для того, чтобы сохранить продукт nanofibrous.

Обратите внимание, что использование ПЭО (или иной высокий молекулярный вес и легко electrospun полимер) имеет важное значение в этом протоколе для поощрения формирования нановолокно, как короткие и сильно разветвленных POEGMA олигомеров самостоятельно не может достичь достаточной степенью запутанности побудить electrospinning; Вместо этого электроспрей результаты на всех процесса условия испытания POEGMA-только составов (хотя это также может иметь приложения для изготовления разложению гель частиц с помощью этой же химия). Для поддержания полностью nanofibrous морфология требуется минимальная концентрация ПЭО 1 wt % (1 MDa молекулярный вес). Обратите внимание, что ПЭО могут быть удалены из волокон после простой процедуры замачивания (деионизированной воды, 24 h) без нарушения целостности сети nanofibrous; Таким образом ПЭО действует скорее как переходные electrospinning помощи чем является неотъемлемой частью окончательного nanofibrous продукта. Также, обратите внимание, что различные виды коллекторов, включая простые алюминиевой фольги (для создания тонкого слоя гидрогели, который может расслаиваться из коллектора после замачивания), а также вращающегося диска алюминия (для создания толще леса) может использоваться в сочетании с этой же техника, представили другие переменные процесса, контролируя уровень гелеобразования, скорость electrospinning и скорость испарения воды во electrospinning остаются неизменными.

Интересно, что в зависимости от метода, используемого для подготовки различных морфологии, существенные различия были отмечены в деградации времена гидрогели, приготовленный из же гидрогеля прекурсоров. Например POEGMA nanofibrous гидрогелей ухудшаться медленнее, чем массовая POEGMA гидрогелей с того же состава, несмотря на их значительно больше площади поверхности и, таким образом, доступ к воде для гидролизуют гидразоны облигаций. Мы связаны эти различия присущие контрасты между описанные протоколы с точки зрения геометрии смешивания прекурсоров полимеров, которые могут привести к внутренней гель homogeneities, морфологии, которые значительно отличаются или в situ концентрации полимера прекурсоров на той же шкале времени как гелеобразования, особенно актуально в electrospinning благодаря одновременной воды испарения и сшивки, наблюдается в этом процессе. Хотя это несколько может осложнить выбор прекурсоров полимеров, если один из полимер предназначен для использования в каждый протокол, он также может предложить техническую возможность с точки зрения принятия гидрогели с одной химический состав, но очень разные физические свойства.

В целом описанные методы обеспечивают стратегию для изготовления разложению (или по крайней мере парентеральному clearable) аналогов thermoresponsive полимеров на различных масштабах длины (основная, микро и нано) и с несколькими типами внутренних структур (частицы или волокна). Такие протоколы решать основные препятствия для успешного перевода условно подготовлен синтетических thermoresponsive материалов в области биомедицины: injectability и разложению. Мы продолжаем исследовать применение таких материалов в доставки лекарств и ткани инженерных приложений, начиная от физического нападения на раков, перевозки наркотиков через гематоэнцефалический барьер, терапевтические доставки белков в задней части глаза, направленный рост тканей и термореверсивные адгезии и дифференцировки клеток, среди других приложений.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансирование от естественных наук и инженерных исследований Совет из Канады (СЕНТИ), создать Сенти-IDEM (интегрированный дизайн внеклеточной матрицы) программа, 20/20: СЕНТИ офтальмологический биоматериалов научно-исследовательская сеть и Онтарио Министерство исследований и Программа раннего исследователь награды инноваций признается.

Materials

Chemicals
2,2 – azobisisobutryic acid dimethyl ester	Wako Chemicals	101138
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA)	Sigma Aldrich	447927	188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475)	Sigma Aldrich	447943	475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units
Acrylic acid (AA), 99%	Sigma Aldrich	147230
Thioglycolic acid (TGA), 98%	Sigma Aldrich	T3758
Dioxane, 99%	Caledon Labs	360481
Nitrogen, UHP grade	Air Liquide	Alphagaz1 765A-44
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98%	Alfa Aesar	A15119
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%)	Carbosynth	FD05800
Hydrochloric acid (HCl), 37%	Sigma Aldrich	320331
Sodium hydroxide (NaOH), 97%	Sigma Aldrich	221465
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99%	Sigma Aldrich	121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97%	Sigma Aldrich	176141
Methacryloyl chloride,97x%	Sigma Aldrich	523216
Petroleum ether, 95%	Sigma Aldrich	32047
Magnesium sulfate, 99.5%	Sigma Aldrich	M7506
tert-Butyl methyl ether, >99.0%	Sigma Aldrich	443808
Phosphate buffered saline	BioShop	PBS405.1	1x, pH 7.3-7.5
N-isopropylacrylamide, 99%	J&K Scientific	258717	Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene
Ethanol, anhydrous	Commerical Alchols	P016EAAN
Span 80	Sigma Aldrich	S6760
Heavy paraffin oil	Caledon Labs	1326197
Pentane, reagent grade	Caledon Labs	1/10/7800
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000	Sigma Aldrich	182028
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication
Rotary evaporator	Heidolph	G3
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off)	Spectrum Labs	28170-166	Vol/length= 6.4mL/cm
Double barrel syringe	Medmix	L series	L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio
Static mixer	Medmix	L series	L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness	McMaster-Carr	9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Syringe pump	KD Scientific	KDS Legato 200	Infuse Only Dual Syringe Pump
High voltage power supply	Spellman	230-20R	0 to 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon wafer	University Wafer	2080	D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation
SU-8 100	MicroChem	Y131273
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100
Custom 2.5" spincoater	Built in-house	N/A
Mask Aligner	KARL SUSS	MJB3 UV400 (with a 276 W lamp)
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing	Cole Parmer	OF-96400-13	Peroxide-cured
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base	Ellsworth Adhesives	4019862
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Ellsworth Adhesives	4019862
High Power Plasma Cleaner	Harrick	PDC-002-HP
Characterization Instruments
Mach 1 micromechanical tester	Biomomentum	LB007-EN
Cellstar tissue culture 12 well plate	Greiner Bio-one	665 180
Cell culture insert for 12 well plate	Corning	08-771-12	8 µm pore size
Optical microscope	Olympus BX51 optical microscope	BX51
Temperature-controlled microscope stage	Linkam Scientific	THMS600
Gel permeation chromatograph (GPC)	Waters	590 HPLC Pump	Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector
Dynamic light scattering (DLS)	Brookhaven	90Plus Particle Size Analyzer
Transmission electron microscopy (TEM)	TEMSCAN	JEOL 1200EX	Accelerating voltage 100 kV
Scanning electron microscopy (SEM)	Tescan	Vega II LSU	Accelerating voltage 10 kV
Microsquisher	CellScale Biomaterials Testing	MS-50M-01

References

Heskins, M., Guillet, J. E. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). J. Macromol. Sci. A. 2 (8), 1441-1455 (1968).
Lutz, J. -. F., Akdemir, &. #. 2. 1. 4. ;., Hoth, A. Point by Point Comparison of Two Thermosensitive Polymers Exhibiting a Similar LCST: Is the Age of Poly(NIPAM) Over. J. Am. Chem. Soc. 128 (40), 13046-13047 (2006).
Pelton, R. H., Chibante, P. Preparation of Aqueous Lattices with N-Isopropylacrylamide. Colloids Surf. 20 (3), 247-256 (1986).
Palasis, M., Gehrke, S. H. Permeability of Responsive Poly(N-Isopropylacrylamide) Gel to Solutes. J. Controlled Release. 18 (1), 1-11 (1992).
Kawaguchi, H., Fujimoto, K., Mizuhara, Y. Hydrogel Microspheres .3. Temperature-Dependent Adsorption of Proteins on Poly-N-Isopropylacrylamide Hydrogel Microspheres. Colloid Polym. Sci. 270 (1), 53-57 (1992).
Okuyama, Y., Yoshida, R., Sakai, K., Okano, T., Sakurai, Y. Swelling Controlled Zero-Order and Sigmoidal Drug-Release from Thermoresponsive Poly(N-Isopropylacrylamide-Co-Butyl Methacrylate) Hydrogel. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 4 (5), 545-556 (1993).
Snowden, M. J. The Use of Poly(N-Isopropylacrylamide) Lattices as Novel Release Systems. J. Chem. Soc. – Chem. Comm. (11), 803-804 (1992).
Haraguchi, K., Takehisa, T., Ebato, M. Control of cell cultivation and cell sheet detachment on the surface of polymer/clay nanocomposite hydrogels. Biomacromolecules. 7 (11), 3267-3275 (2006).
Lee, B., et al. Initiated chemical vapor deposition of thermoresponsive poly(N-vinylcaprolactam) thin films for cell sheet engineering. Acta Biomater. 9 (8), 7691-7698 (2013).
Cole, M. A., Voelcker, N. H., Thissen, H., Griesser, H. J. Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions. Biomaterials. 30 (9), 1827-1850 (2009).
Feil, H., Bae, Y. H., Feijen, J., Kim, S. W. Molecular Separation by Thermosensitive Hydrogel Membranes. J. Membrane Sci. 64 (3), 283-294 (1991).
Kim, J., Park, K. Smart hydrogels for bioseparation. Bioseparation. 7 (4-5), 177-184 (1998).
Yamashita, K., Nishimura, T., Nango, M. Preparation of IPN-type stimuli responsive heavy-metal-ion adsorbent gel. Polym. Adv. Tech. 14 (3-5), 189-194 (2003).
Ziolkowski, B., Czugala, M., Diamond, D. Integrating stimulus responsive materials and microfluidics: The key to next-generation chemical sensors. J. Intelligent Mater. Syst. Struct. 24 (18), 2221-2238 (2013).
Zhang, Y., Kato, S., Anazawa, T. A flap-type hydrogel actuator with fast responses to temperature. Smart Mater. Struct. 16 (6), 2175-2182 (2007).
Suzuki, D., Taniguchi, H., Yoshida, R. Autonomously Oscillating Viscosity in Microgel Dispersions. J. Am. Chem. Soc. 131 (34), 12058-12059 (2009).
Schild, H. G. Poly(N-isopropylacrylamide): Experiment, Theory and Application. Prog. Polym. Sci. 17, 163-249 (1992).
Oh, J. K., Min, K., Matyjaszewski, K. Preparation of poly (oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate) by homogeneous aqueous AGET ATRP. Macromolecules. 39 (9), 3161-3167 (2006).
Vihola, H., Laukkanen, A., Tenhu, H., Hirvonen, J. Drug Release Characteristics of Physically Cross-Linked Thermosensitive Poly(N-vinylcaprolactam) Hydrogel Particles. J. Pharm. Sci. 97 (11), 4783-4793 (2008).
Zhang, L. F., Liang, Y., Meng, L. Z. Thermo-sensitive amphiphilic poly(N-vinylcaprolactam) copolymers: synthesis and solution properties. Polym. Adv. Tech. 21 (10), 720-725 (2010).
Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable and tunable poly(ethylene glycol) analogue hydrogels based on poly(oligoethylene glycol methacrylate). Chem. Comm. 50 (25), 3306-3309 (2014).
Lutz, J. -. F. Polymerization of oligo (ethylene glycol)(meth) acrylates: toward new generations of smart biocompatible materials. J. Polym. Sci. A. 46 (11), 3459-3470 (2008).
Lutz, J. -. F., Hoth, A. Preparation of Ideal PEG Analogues with a Tunable Thermosensitivity by Controlled Radical Copolymerization of 2-(2-Methoxyethoxy)ethyl Methacrylate and Oligo(ethylene glycol) Methacrylate. Macromolecules. 39 (2), 893-896 (2006).
Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Degradable Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide) Hydrogels. ACS Macro Lett. 1 (3), 409-413 (2012).
Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Mixed Natural-Synthetic Polymer Hydrogels with Modular Properties. Biomacromolecules. 13 (2), 369-378 (2012).
Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable poly(oligoethylene glycol methacrylate)-based hydrogels with tunable phase transition behaviours: Physicochemical and biological responses. Acta Biomater. 10 (10), 4143-4155 (2014).
Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Temperature-Induced Assembly of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, and Degradable Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels Based on Oligomeric Precursors. Langmuir. 31, 5767-5778 (2015).
Bakaic, E., Smeets, N. M. B., Dorrington, H., Hoare, T. “Off-the-shelf” thermoresponsive hydrogel design: tuning hydrogel properties by mixing precursor polymers with different lower-critical solution temperatures. RSC Adv. 5 (42), 33364-33376 (2015).
Bulpitt, P., Aeschlimann, D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: Preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 47 (2), 152-169 (1999).
Kesselman, L. R. B., Shinwary, S., Selvaganapathy, P. R., Hoare, T. Synthesis of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, Degradable “Smart” Microgels Using Microfluidics. Small. 8 (7), 1092-1098 (2012).
Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Microfluidic production of degradable thermoresponsive microgels based on poly(N-isopropylacrylamide). Soft Matter. , (2016).
Xu, F., Sheardown, H., Hoare, T. Reactive Electrospinning of Degradable Poly(oligoethylene glycol methacrylate)-Based Nanofibrous Hydrogel Networks. Chem. Comm. 52 (7), 1451-1454 (2016).
Troll, K., et al. The collapse transition of poly(styrene-b-(N-isopropyl acrylamide)) diblock copolymers in aqueous solution and in thin films. Colloid Polym. Sci. 286 (8), 1079-1092 (2008).
Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
Kelly, T. A., Felder, M. S., Ollar, R. A. Inducing Apoptosis in a Mammalian Cell by Contacting with Paraffin or Agar. US Patent. , (2001).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Sivakumaran, D., Bakaic, E., Campbell, S. B., Xu, F., Mueller, E., Hoare, T. Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning. J. Vis. Exp. (134), e54502, doi:10.3791/54502 (2018).