Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
وجود قيود على HIV-1 العلاجات الحالية هو أنها يجب أن تدار بشكل مزمن لمنع تطور المرض. زرع HIV-1 مقاومة T اللمفاوية، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم، لديه القدرة على توفير مراقبة طويلة المدى من فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في غياب العلاج بالعقاقير 1،2 و قد يكون أيضا نهج فعال لتحقيق لعلاج HIV-1 3. طريقة واحدة لجعل خلايا مقاومة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها هي لادخال واحد أو أكثر من الجينات الترميز لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا أو الببتيدات إلى خلايا الفرد المصاب خلال زرع ذاتي 4. وقد صممت مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الجينات العديد من مرشح مع بعض التجارب السريرية التي تدخل في مجموعات من اثنين أو ثلاثة 5 6، لمنع تطور HIV-1 مقاومة أي جين واحد.
مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا هي من بين أكبر المرشحين للالجمع بين العلاج الجيني نظرا لقدرة منخفضة على الحصول على ردود المناعة ولأنهموكتب من تسلسل الجينات قصيرة جدا. وقد صممت بعض مضادات HIV-1 الرنا لاستهداف دخول الفيروس والتكامل. ومع ذلك، فإن معظم لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا تستهدف خطوات ما بعد التكامل في دورة حياة الفيروس (الشكل 1). وتشمل مثبطات بعد التكامل الرنا شرك، واستهداف HIV-1 البروتينات التنظيمية تات أو القس 1، والرنا القائم على العقاقير استهدفت مواقع مختلفة في HIV-1 الحمض النووي الريبي، مثل الريبوزيمات 7، 8 shRNAs وU1i الرنا 9. وتشمل الأساليب التي استخدمت لمقارنة فعالية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1-الرنا رصد تكاثر الفيروس في الخلايا transduced مع جينات ترميز لالرنا مرشح وقياس الانتاج الفيروسية في الخلايا transfected عابر مع البلازميدات التعبير عن الرنا مرشح والتعبير البلازميد HIV-1 10 -13. لقد كانت تستخدم في السابق لإنتاج فحص HIV-1 لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي للمواقع المستهدفة إنزيم الحمض النووي الريبوزي جديد 13-15. ومنذ ذلك الحين تم تنقيح هذه الأساليب لتحسين شكل من RNAتدخل جزيء أعرب عن البلازميد باعتبارها shRNA أو تسليمها باعتبارها سيرنا الاصطناعية (16). الفحص يقيس إنتاج الفيروسات الناضجة من خلايا 293T الإنسان الكلى الجنينية (كلوة)، ويمكن استخدامها لمقارنة آثار مثبطات التي تستهدف الخطوات في مرحلة ما بعد الاندماج في دورة النسخ المتماثل HIV-1 (الشكل 1). لمثبطات التي تستهدف خطوات ما قبل الاندماج، وهناك حاجة إلى فحوصات بديلة مثل-تزم BL خلية العدوى فحص 17 لتقييم فعالية المضادة للفيروسات.
وتشمل مخاوف تتعلق بالسلامة الرئيسية لإيصال مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا في العيادة المحتملة الآثار بعيدا عن الهدف على الرنا أو البروتينات الإنسان، وتفعيل أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية. لتقييم سمية مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرناوات siRNAs، وقد استخدمنا مقايسة بقاء الخلية في خطوط مختلفة من الخلايا 16. نحن أيضا قياس تفعيل مزدوجة أجهزة الاستشعار المناعة الحمض النووي الريبي RNA، RNA تنشيط بروتين كيناز R (PKR) وتول مثل مستقبلات 3 (TLR3)، فضلا عن السابقالضغط وللفيروسات تحفيز الجينات، P150 ADAR1. هذه المقايسات يمكن استخدامها للتأكد من فعالية لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية-1 الرنا لا يرجع إلى الآثار غير المباشرة على بقاء الخلية أو تفعيل جهاز الاستشعار المناعي. كما أنها مفيدة في استبعاد الرنا مرشح مع سمية محتملة من مزيد من التطوير.
في البروتوكولات التالية، الإجراءات الخاصة بتحديد الرنا علاجية جديدة وتحسين توصف شكل القائمة. طرق مفيدة لفحص الحمض النووي الريبي تستند مثبطات بعد دمج HIV-1 تكرارها ويمكن تكييفها لفحص مثبطات بعد التكامل الأخرى، مثل الجزيئات الصغيرة التي تستهدف القس تصدير بوساطة من الحمض النووي الريبي الفيروسي 18 أو كريسبر / نظم كاس مصممة لاستهداف متكامل HIV-1 الحمض النووي (19).
تم تنفيذ إنتاج فحص HIV-1 صفها باستخدام خلايا HEK293T (الشكل 2) ومشابه لفحوصات المستخدمة لفحص HIV-1 الحمض النووي الريبي لإنزيم الحمض النووي الريبوزي فعال 13، shRNA 10،29، سيرنا 30، وU1i RNA مواقع 11،31 الهدف. باستخدام أساليب مختلفة لتحديد إنتاج HIV-1، وقياس …
The authors have nothing to disclose.
وأيد العمل المقدم هنا من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) (يمنح DCB-120266، PPP-133377 وHBF-348967 لAG).
DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
[32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |