Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü
Summary
Burada, biz kemostat kültür kullanarak koşullar altında mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimini elde etmek için bir protokol mevcut. Ayrıca, gelişmiş soyunun genomik analiz tartışılmıştır.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Mikroorganizmalar hayatta ve çeşitli ortamlara uyum sağlayabilir. Ağır stres altında, adaptasyon rastgele genomik mutasyonların ve sonraki pozitif seleksiyon 1-3 yararlı fenotip kazanması ile ortaya çıkabilir. Bu nedenle, mikrobiyal hücreler "adaptif evrim" olarak adlandırılır optimum büyüme için metabolik veya düzenleyici ağları değiştirerek uyum sağlayabilir. Bu tür süpermikroplar salgınları ve sağlam mikrobiyal suşların ortaya çıkması gibi yeni önemli mikrobiyal eğilimler, çok yakından stresli koşullar altında evrimi uyarlamalı ilişkilidir. tanımlanan laboratuvar koşullarında, moleküler evrim mekanizmaları incelemek ve hatta çeşitli uygulamalar için mikrobik evrimin yönünü kontrol edebiliyoruz. onlar büyük nüfusları korumak, hızlı bir şekilde yeniden ve oluşturmak ve Hom bakımı kolaydır: Çok hücreli organizmalardan farklı, tek hücreli canlılar aşağıdaki nedenlerden ötürü adaptif laboratuvar evrim (ALE) için uygundurogeneous ortamlar. DNA dizileme teknikleri ve yüksek verimli teknolojilerindeki son gelişmeler ile birlikte, ALE sistemik düzenleyici değişikliklere yol genomik değişikliklerin doğrudan gözlem sağlar. Mutasyon dinamikleri ve nüfus çeşitliliği de gözlemlenebilir. Genetik mühendisliği yöntemi ALE suşlarının 4,5 analizinden belirlenebilir.
Kemostat kültür kararlı durum hücreleri elde etmek ve fermantasyon süreçleri 6 verimliliği artırmak için kullanılan bir yöntemdir. Taze ortam ilave edilir ve kültür sıvısı işlemi (ikinci orta ve biyokütle içerir) içinde toplanır. Uzun vadeli kemostat kültürü Bununla birlikte, kültürün kararlı durum verimliliği değiştirir ve kültür (Şekil 1a) sırasında spontan mutasyon ve seleksiyon birikimi getiriyor. Çeşitli seçim basınçlarında (stres) altında, mutasyonların birikimi artar. Uzun vadede stres kademeli bir artış kemostat tekrarlanan sıvı bir ortamda bir katı ortam ve seri transferi (arasında, sıcaklık, pH, ozmotik basıncı, besin açlık, oksidasyon, toksik son ürün, vb Koloni transferi verilen stres karşı çalışma mutasyonlar, sürekli bir seçim sağlar küme kültür), araştırmacılara gelişti mikroorganizmaları (Şekil 1B ve 1C) elde edilmesine olanak sağlamaktadır. kemostat kültür karmaşık yöntemler gerektirmesine rağmen, çeşitlilik havuzu (tekrarlamalı ve nüfus büyüklüğü sayısı) koloni transfer ve seri transfer teknikleri ile elde edilenden daha yüksektir. tek tek hücrelerin kararlı stres maruziyeti ve kemostat kültürü (sabit durum) toplu kültür temelli tekniklerle karşılaştırıldığında ALE diğer faydaları şunlardır sırasında hücresel devlet varyasyon azalmıştır. Yüksek süksinat koşullara tabi Escherichia coli strese bağlı ALE Bu makalede tanıtıldı.
iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
Şekil 1: adaptif laboratuvar evrim Yöntemleri (A) Kemostat;. (B) Seri transferi; (C) koloni transferi. Üst rakamlar ALE yöntemleri kavramını göstermek ve alt rakamlar ALE sırasında büyüyen hücrelerin sayısını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroorganizmalar nedeniyle hızlı büyüme oranı ve genetik çeşitliliğin hemen hemen tüm ortamlarda uyum yeteneğine sahiptirler. Adaptif laboratuvar evrim verilen koşullar altında yararlıdır spontan mutasyon barındıran bireysel organizmaların seçerek bir yol sağlar tasarlanmış koşullar altında gelişmeye mikroorganizmaları sağlar.
kemostat tekniği aşağıdaki nedenlerle transfer teknikleri daha yapay tahrik evrimi elde etmek için daha sağlamdır, (a) sürekli bir o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
