Trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa

Todo el trabajo en vivo descrito es aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Universidad de Cornell. 1. Preparación de muestras para ensayos de ovario almohadilla de grasa Aislamiento y cultivo de células primarias de trompas Epitelio (TE) La eutanasia a los donantes de 6 a 8 semanas de edad virgen proteína verde fluorescente mejorada-β-actina (EFGP) o ratones β-actina-Discosoma proteína roja fluorescente (DsRed) por CO 2 administración seguido por dislocación cervical. Verificar la eutanasia con éxito por una pizca dedo del pie. Coloque un ratón individual en una cortina absorbente, lado ventral hacia arriba, y luego limpie el abdomen con un 70% de etanol. Abra la piel haciendo una incisión lateral a la línea media del cuerpo y con la punta de los dedos tiran de la piel por encima y por debajo de la incisión hacia la cabeza y la cola del ratón. Mantenga el peritoneo con unas pinzas romas y hacer un corte con tijeras finas para abrir la cavidad del cuerpo. Empuje suavemente la bobina del intestine un lado y localizar los órganos reproductores. Con unas pinzas finas recoger un cuerno uterino y debe cortar 0,5 cm por encima del punto en el que se separan los cuernos uterinos. Mientras sostiene el cuerno uterino, diseccionar el tejido conectivo unido a la trompa uterina, trompa uterina, almohadilla de grasa de ovario y cáncer de ovario. Coloque tracto reproductivo diseccionado en un plato con 6 ml estéril salina tamponada con fosfato (PBS). Proceder con el segundo aparato reproductor. Se pasa la placa a una cabina de bioseguridad y lavar los tejidos 3 veces en 6 ml de PBS estéril. Continuar el trabajo bajo un microscopio de disección situado en la cabina de bioseguridad. Coge el cuerno uterino con unas pinzas finas y desconecte el cuerno uterino de la trompa uterina mediante el corte en la unión útero-tubárica. Cortar la bolsa ovárica que rodea el ovario mediante el uso de una aguja de 25 G. Nota: Después de la bolsa ovárica se ha eliminado, la disección es completa y la trompa uterina individuo permanece en la solución de PBS. Transferir una cabeza del ctrompa uterina e en una caída de 50 l de PBS a una placa de 3,5 cm y tiene pelos en trozos de 0,1 mm utilizando agujas de calibre 28. Traslado a 200 l de tampón de digestión 1 (Modificado (DMEM) F12 de Eagle de Dulbecco () medio de Ham suplementado con 300 unidades ml-1 de colagenasa y 100 unidades de ml -1 hialuronidasa) e incubar durante 1 hora a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora. Después de la incubación, añadir ácido etilendiaminotetraacético Tripsina-1 ml 0,25% (EDTA) y la suspensión de la solución con la ayuda de una punta de pipeta 1 ml (también conocido como punta azul) 20 veces durante 3 minutos. Añadir 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal al 2%. Recoger los tejidos por centrifugación (600 RCF, 5 min, temperatura ambiente (RT)), y añadir tampón de digestión 1 ml 2 (DMEM F12 () medio de Ham suplementado con 7 mg ml -1 dispasa II y 10 mg ml -1 desoxirribonucleasa I ( DNasa I)). Suspender sedimento de tejido 20 veces con la ayuda de una pipeta de 1 ml tipag. Añadir medio completo libre de suero de 5 ml del crecimiento del ratón epitelio tubárico (M-TE-GM, Tabla 1). Recoger las células por centrifugación (600 rcf, 5 min, RT). Añadir 1 ml de M-TE-GM, suspender y contar las células mediante un hemocitómetro. Semillas 1 x 10 5 células en 1 ml por pocillo en una placa de 24 pocillos de baja unión y se incuban en M-TE-GM a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 4 días. Cambiar el medio cada día. Preparar suspensiones de células individuales de células TE suspensión primaria cultivadas a partir de ratones ß-actina-EGFP o β-actina-DsRed. Recoger los cultivos en suspensión TE de 24 pocillos placas de fijación bajas. Centrifugar (600 RCF, 5 min, RT), y suspender los sedimentos celulares con 1 ml 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Deja de actividad de la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal 5%. Recoger los sedimentos celulares por centrifugación (600 RCF, 5 min, RT). sedimentos de células de lavado dos veces con 4 ml de PBS frío (4 ° C), se añade 1 ml de PBS por sedimento celular, y suspender. Recuento de células mediante un hemocitómetro y la transferencia a 1,7 ml tubos de centrifugación. Trabajando en hielo, añadir 1 x 10 5 células a 10 l de PBS, a continuación, añadir la matriz de la membrana basal 10 l. Suspender y transportar en hielo a la sala de los animales. Nota: Realizar todos los trabajos de disección y el tejido de cultivo en una cabina de bioseguridad en condiciones estériles. Preparación de la línea celular inmortalizada humana Por separado crecer lentivirus-EGFP y -mCherry marcado inmortalizada humana superficial del ovario lineHIO118 célula epitelial hasta el 80 – 90% de confluencia en placas de 10 cm a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Lavar los platos dos veces con 10 ml de PBS, se añade 1 ml de 0,25% tripsina-EDTA por placa y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Detener la reacción mediante la adición de 10 ml de DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal 5%. Recogersedimentos celulares por centrifugación (600 rcf, 5 min, RT). sedimentos de células de lavado dos veces con 10 ml de PBS frío (4 ° C), se añade 1 ml de PBS por sedimento celular, y suspender. Recuento de células mediante un hemocitómetro y la transferencia a 1,7 ml tubos de centrifugación. Trabajando en hielo, añadir 1,0 x 10 6 células Lenti-mCherry etiquetados + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP células marcadas con 10 l de PBS. Añadir matriz de membrana basal 10 l. Suspender y transportar en hielo a la sala de los animales. Preparación de la trompa uterina Diseccionar trompas uterinas individuales de 6 a 8 semanas de edad ratones vírgenes β-actina-DsRed en PBS como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.5. Transferencia trompas uterinas individuales en una gota 200 l de PBS con un microscopio de disección. desenrolle suavemente trompas uterinas con la ayuda de pinzas y agujas de calibre 28 mediante la eliminación de la mesosalpinx, una parte del ligamento ancho que soporta los segmentos de la trompa uterina. Coloque trompas uterinas desenrollados individuales en una gota de 200 l de PBS frío hielo hasta que la almohadilla de grasa de ovario del destinatario se expone y se preparó para recibir el trasplante. 2. Trasplante de ovario almohadilla de grasa Nota: Desinfectar instrumentos entre cada cirugía animal. Preparar y organizar todos los equipos con antelación. trasplantes dorsal a la almohadilla de grasa ovárica derecha son preferenciales ya que esto evita el bazo. Sin embargo, los receptores de trasplantes pueden tener tanto en las almohadillas de grasa de ovario. Utilizar ratones singénicos o ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID / NCR) como receptores de células primarias. Para las células humanas, tales como células, HIO118 / ratones SCID uso Nod / gamma (GSN) o ratones SCID. Anestesie ratón receptor con una sola inyección intra-peritoneal de 2,2,2-tribromoetanol a una dosis de 0,15 ml / 10 g de peso corporal. Colocar el animal sobre una almohadilla térmica, en la campana animal y confirmar la anestesia adecuada por la pérdida del reflejo de pedal (pizca dedo del pie). Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que elanimal es bajo anestesia. Se inyecta por vía subcutánea el animal con el analgésico ketoprofeno en dosis de 4 mg / g de peso corporal para el tratamiento para el dolor post-quirúrgico. Nota: Como alternativa, el uso de anestesia con isoflurano. Colocar el animal en la cámara de inducción y ajustar el medidor de flujo de oxígeno al 0,8 a 1,5 L / min y el vaporizador de isoflurano al 2-3%. Retire el animal anestesiado de la cámara, que lo respira isoflurano de una máscara y ajustar el medidor de flujo de oxígeno a 0,4-0,8 l / min y el vaporizador de isoflurano al 1,5%, a continuación, iniciar la cirugía. Afeitar el área quirúrgica con máquinas de cortar # 40; eliminar el vello de un área de 2 veces el área quirúrgica, preparar la piel afeitada con tres friega antisépticas de povidona yodada, seguido de etanol al 70%, y cubrir con un paño estéril. Mover el animal bajo un microscopio de disección situado en una cabina de bioseguridad. Exponer el aparato reproductor mediante una incisión en la posición dorsomedial directamente encima de la almohadilla de grasa de ovario. Nota: Critpaso ical: incisión de la piel Precise facilita la cicatrización de heridas, el uso de un bisturí se recomienda en el paso 2.4. Utilizando unas pinzas finas romos tire de la almohadilla de grasa de ovario cuidadosamente a través de la incisión hacia la línea media, se minimiza el daño a los nervios y los vasos sanguíneos principales. Paso Crítico: Si se produce una hemorragia, detener la cirugía y considerar el trasplante a un animal huésped diferente. Bajo el control del microscopio de disección con la ayuda de una aguja de calibre 28 biselado hacer una incisión profunda de 2-4 mm en la almohadilla de grasa de ovario, 3-4 mm por encima del ovario. paso crítico: Asegúrese de que la incisión única pasa por la mitad de la almohadilla de grasa; punción de todo el camino a través de la parte inferior provoca fugas. Ser rápida y proceder sin demora después de este paso. Para los trasplantes de células, llenar una jeringa (aguja de calibre 30) con 10-20 l de la membrana de la matriz-mezcla de células-sótano y se inyecta en la incisión almohadilla de grasa. Para el trasplante de trompa uterina, recoger el ingenio trompa uterinah pinzas finas y colocarlas en 10 – matriz de la membrana basal 20 l mantuvieron en hielo. El uso de un 0,1-10 l / 20 XL graduó punta del filtro (se ha reducido en un 3 mm) recoger el tejido y la suspensión de la membrana basal de la matriz y la liberación en la incisión almohadilla de grasa. Espere 5 minutos para que la matriz de la membrana basal para solidificar y colocar el tracto reproductivo de nuevo en el peritoneo. Cierre los músculos con 2 puntos de sutura de sutura quirúrgica y la piel con dos clips pequeña herida o sutura quirúrgica. Repita los pasos 2.4-2.8 para trasplantar una matriz de mezcla de membrana PBS-sótano en la almohadilla de grasa contra-lateral del animal que servirá como control. paso crítico: Después de la cirugía de colocar al animal en una almohadilla eléctrica, debido a la pérdida de calor es rápida en ratones anestesiados. Deje que los animales se recuperan en una almohadilla térmica en la jaula nativa y observar el animal hasta que esté completamente despierto de la anestesia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para mantener los esternonesl decúbito. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Coloque un puñado de bolitas de comida pre-húmedas dentro de la jaula, además de secar el alimento en la jaula después de la cirugía. Aplicar analgésicos post-quirúrgicos si es necesario para los próximos días y examinar la herida diariamente. Aplicar los antibióticos de acuerdo con el protocolo aprobado de animales si se produce la infección de la herida. Retirar grapas para heridas 10 días después de la cirugía cuando la herida se ha cerrado completamente. 3. Histología y Adquisición de imágenes Injerto de recolección y preservación Preparar la solución de paraformaldehído al 4% mezclando 26 ml ddH2O con 4 ml 10x PBS y solución de paraformaldehído 10 ml de 16%. Diseccionar en un bloque, la almohadilla de grasa ingerida en los ovarios, ovario, trompa de Falopio, el útero de 0,5 cm como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.4. colocar inmediatamente en 2 ml de paraformaldehído al 4% y fijar durante 2 horas, a temperatura ambiente. Desde el mismo animal, diseccionar la no injertadosistema de almohadilla de grasa de ovario contralateral trasplantados con PBS-sótano mezcla matriz de la membrana como un control (véase el paso 2.9). Fijar y el proceso de la misma manera. Después del lavado de fijación tejidos tres veces con PBS durante 5 min y se incuba durante la noche en PBS a 4 ° C. Para todo el montaje en la obtención de imágenes de la almohadilla de grasa de ovario continúe en el paso 3.2.1. Nota: Después de que los tejidos de adquisición de imágenes se pueden congelar (3.3.1) o tratados para la inclusión en parafina (3.3.2). incubación durante la noche en 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C mejora la calidad de los tejidos congelados. Adquisición de imágen Coloque todo el montaje en sistemas de la capa de grasa de ovario en los platos de PBS llenas y la imagen usando un microscopio invertido equipado con el accesorio de epi-fluorescencia y cámara a color de alta definición, con 4, 10 veces más objetivos, y un estereomicroscopio equipado con un accesorio de fluorescencia, cámara a color y el Plan Apo 1xWD70, objetivos ED plan de 1.5xWD45. Histología Siguiendotodo el montaje de adquisición de imágenes (3.2.1) se coloca una gota de 200-500 l de medio de inclusión para las muestras de tejido congelado en una pieza de 2 x 1 cm de la película de laboratorio y el uso de fórceps, transferir el tejido de la caída. Recoge la película en un borde y transferir la caída del tejido de mediano a un vial criogénico ml 1.8. Cerrar el vial y sumergirse en nitrógeno líquido. Almacenar tejidos congelados a -80 ° C. Como alternativa, proceder a la inclusión en parafina estándar. Utilice 20-40 volúmenes de volumen de tejido para cada paso. Sumergir los tejidos una vez en 65% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. Sumergir los tejidos una vez en 70% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. En esta etapa las muestras se pueden almacenar durante meses a temperatura ambiente. Sumergir los tejidos una vez en 90% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. Sumergir los tejidos una vez en 95% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. Sumergir los tejidos dos veces en etanol absoluto (200 prueba) durante 30 min, agitando suavemente a TA. <li> Sumergir los tejidos dos veces en cloroformo durante 30 minutos, agitando suavemente a TA. Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 30 minutos, agitando suavemente a 58 ° C. Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 12 horas, agitando suavemente a 58 ° C. Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 3 horas, a 58 ° C. Colocar en moldes de tejidos histológicos de metal y llenar los moldes con 58 ° C de parafina. Añadir un casete histología de plástico en la parte superior de la parafina y parafina se enfríe a 4 ° C. Extraer bloques de parafina de los tejidos y se almacena a temperatura ambiente. Nota: temperatura de parafina no debe exceder de 58 ° C para la conservación óptima de tejido adecuada para tinción inmunohistoquímica. Alternativamente, Prepárese para la inclusión en parafina con Espécimen de procesamiento del gel. Aspirar el PBS y transferir los tejidos de todo el montaje y el 70% de etanol. Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr. En un baño de agua, la muestra de procesamiento de precalentamiento de gel a 60 ° C. pipeteee 200 l de gel de procesamiento de muestras en una placa de Petri forrada con película de laboratorio. Utilizando unas pinzas de disección finas transferir todo el montaje del sistema de tejidos a la caída de gel de procesamiento de las muestras. Deje que el tapón de gel de procesamiento de las muestras se solidifique a temperatura ambiente, o se solidifique el tapón durante 10 min a 4 ° C. Coloque el tejido embebido gel procesamiento de muestras en cassettes de tejido histología intercaladas entre almohadillas de espuma biopsia. Incrustar en parafina como en los pasos 3.3.2-3.3.2.10. Nota: Espécimen de procesamiento incrustación de gel evita la pérdida y permite la conservación de las pequeñas muestras de tejidos frágiles. Nota: Los tejidos conservados por congelación o la inclusión en parafina son adecuados para la tinción inmunohistoquímica 14,15.