Transplantação no Pad Mouse ovário Fat

Todo o trabalho in vivo descrito é aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Cornell. 1. Preparações de exemplo para o ovário Fat Pad Ensaios Isolamento e Cultura Primária Tubal Epitélio Cells (TE) Eutanásia dador com 6 a 8 semanas de idade virgem β-actina-Proteína Fluorescente Verde melhorada (EFGP) ou Proteína Fluorescente Vermelha (DsRed) ratinhos β-actina Discosoma-CO 2 por administração seguido por deslocamento cervical. Verifique a eutanásia bem sucedida por uma pitada dedo do pé. Coloque um ratinho individual em uma cortina absorvente, ventral lateral-se, em seguida, limpe o abdômen com etanol 70%. Abrir a pele, fazendo uma incisão lateral à linha média do corpo e com a ponta dos dedos puxar a pele acima e abaixo da incisão na direcção da cabeça e cauda do rato. Segure o peritônio usando uma pinça sem corte e fazer um corte com uma tesoura fina para abrir a cavidade do corpo. Com cuidado, empurre a bobina do intestinum e de lado e localizar os órgãos reprodutores. Com uma pinça fina pegar um corno uterino e corte de 0,5 cm acima do ponto onde os cornos uterinos separar. Enquanto mantém o corno uterino, dissecar o tecido conjuntivo anexado ao corno uterino, tubas uterinas, almofada de gordura ovário e ovariano. Coloque trato reprodutivo dissecado em um prato com 6 ml estéril salina tamponada com fosfato (PBS). Prosseguir com a segunda trato reprodutivo. Colocar a cápsula para uma cabine de segurança biológica e lavar os tecidos 3 vezes em 6 ml de PBS estéril. Continuar o trabalho sob um microscópio de dissecação localizado no armário de Biossegurança. Agarre o corno uterino com uma pinça fina e desligue o corno uterino da tuba uterina, cortando na junção útero-tubária. Cortar a bursa ovariana em torno do ovário usando uma agulha 25 G. Nota: Após a bolsa do ovário foi removido, a dissecção está completa e o tubo uterino indivíduo permanece na solução de PBS. Transferir um single tuba uterina em uma queda de 50 ul de PBS a um 3,5 cm de placa e pique em pedaços de 0,1 mm utilizando 28 agulhas de calibre. Transferir para 200 tampão de digestão ul 1 (Modificado (DMEM) F12 de Eagle da Dulbecco () meio de Ham suplementado com 300 unidades de ml-1 de colagenase e 100 unidades de ml-1 de hialuronidase) e incubar durante 1 hora a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora. Após a incubação, adicionar 1 ml de 0,25% Tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e suspender a solução com a ajuda de uma pipeta de 1 ml de ponta (aka ponta azul) 20 vezes durante 3 minutos. Adicionar 5 ml de + 4 ° C DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 2%. Recolha de tecidos por centrifugação (600 rcf, 5 min, temperatura ambiente (RT)), e adicionar 1 ml de tampão de digestão de 2 (DMEM F12 () meio de Ham suplementado com 7 mg mL -1 Dispase II e 10 ug mL-1 desoxirribonuclease I ( ADNase I)). Suspender sedimento de tecido de 20 vezes com a ajuda de uma pipeta de 1 ml de TIp. Adicionar meio completo livre 5 ml de soro de crescimento de camundongo tubária epitélio (M-TE-GM, Tabela 1). Recolher as células por centrifugação (600 RCF, 5 min, RT). Adicione 1 ml M-TE-GM, suspender e contagem de células por hemocitômetro. Semente 1 x 10 5 células em 1 ml por poço numa placa de 24 poços e incubar baixo fixação em M-Te-GM a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 4 dias. Mudar o meio todos os dias. Preparar suspensões de células únicas de células TE suspensão primárias cultivadas a partir de murganhos p-actina-EGFP ou β-actina-DsRed. Recolhe culturas em suspensão de TE de placas de 24 cavidades de fixação de baixo. Centrífuga (600 rcf, 5 min, temperatura ambiente), e suspendê-peletes de células com 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar durante 10 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Pare a actividade da tripsina por adição de 5 ml de DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 5%. Recolher os sedimentos celulares por centrifugação (600 rcf, 5 min, RT). Lavar os sedimentos celulares duas vezes com 4 ml de PBS frio (4 ° C), juntar 1 mL de PBS por cada pelete de células, e de suspensão. Contagem de células pelo hemocitómetro e transferir para tubos de 1,7 ml de centrifugação. Trabalhar em gelo, adicionar 1 x 10 5 células a 10 uL de PBS, em seguida, adicionar matriz de membrana basal de 10 ul. Suspender e transportar no gelo para a sala de animal. Nota: Execute todas dissecção e tecido trabalho de cultura em uma cabine de segurança biológica em condições estéreis. Preparação de Linha de Células humanas imortalizadas Separadamente crescer lentivírus-EGFP e -mCherry marcado humana imortalizada lineHIO118 celular do epitélio da superfície do ovário, até 80-90% de confluência em placas de 10 cm a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Lavar pratos duas vezes com 10 ml de PBS, adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por placa e incubar durante 10 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Parar a reacção por adição de 10 ml de DMEM / F12 (de Ham) contendo soro fetal bovino a 5%. coletaros sedimentos celulares por centrifugação (600 RCF, 5 min, RT). Lavar os sedimentos celulares duas vezes com 10 ml de PBS frio (4 ° C), juntar 1 mL de PBS por cada pelete de células, e de suspensão. Contagem de células pelo hemocitómetro e transferir para tubos de 1,7 ml de centrifugação. Trabalhar em gelo, adicionar 1,0 X 10 6 células Lenti-mCherry rotulados + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP células marcadas com 10 ul de PBS. Adicionar matriz de membrana basal de 10 ul. Suspender e transportar no gelo para a sala de animal. Preparação da tuba uterina Dissecar tubos uterinos individuais a partir de 6 a 8 semanas de idade os ratinhos virgens β-actina-DsRed em PBS como descrito nos passos 1.1.1-1.1.5. Transferir tubos uterinos individuais em uma gota 200 ul de PBS sob um microscópio de dissecção. Suavemente desenrole tubos uterinos com a ajuda de pinças e agulhas de calibre 28 através da remoção do mesossalpinge, uma porção do ligamento largo que é compatível com os segmentos do tubo uterino. Coloque individuais tubas uterinas desenroladas em uma queda de 200 ul PBS gelado até ovário almofada de gordura do destinatário está exposta e preparado para receber o transplante. 2. ovário Fat Pad Transplantation Nota: Desinfetar instrumentos entre cada cirurgia animal. Preparar e organizar todos os equipamentos com antecedência. transplantes dorsal para a almofada de gordura ovário direito são preferenciais, pois isso evita o baço. No entanto, os destinatários podem ter transplantes em ambas as bolsas de gordura ovarianos. Use ratinhos singénicos ou camundongos Imunodeficiência Combinada Grave (SCID / NCR) como receptores de células primárias. Para as células humanas, tais como HIO118 células, / SCID / gama ratos uso Nod (NSG) ou SCID. Anestesiar rato destinatário com uma única injecção intra-peritoneal de 2,2,2-tribromoetanol a uma dosagem de 0,15 ml / 10 g de peso corporal. Colocar o animal numa almofada de aquecimento, na capa de animais anestesiados e confirmar adequada pela perda de reflexo do pedal (aperto do dedo do pé). Aplicar vet pomada nos olhos para evitar a secura, enquanto oanimal está sob anestesia. Injectar o subcutaneamente animal com o Cetoprofeno analgésico a uma dosagem de 4 mg / g de peso corporal para o tratamento de dor pós-cirúrgica. Nota: Como alternativa, use o isoflurano para a anestesia. Colocar o animal na câmara de indução e ajustar o medidor de fluxo de oxigénio para 0,8-1,5 L / min e o vaporizador de isoflurano para 2-3%. Remover o animal anestesiado da câmara, deixá-lo respirar isoflurano a partir de uma máscara e definir o medidor de fluxo de oxigênio para 0,4-0,8 L / min e o vaporizador isoflurano a 1,5%, em seguida, iniciar a cirurgia. Raspar a área cirúrgica com # 40 clippers; remover o cabelo de uma área de 2 vezes a área cirúrgica, preparar a pele raspada com três esfrega anti-séptico de iodo-povidona, seguido por 70% de etanol, e cobrir com uma cortina estéril. Mova o animal sob um microscópio de dissecação localizado em uma cabine de segurança biológica. Expor o tracto reprodutor por uma incisão na posição dorsomedial directamente por cima da almofada de gordura do ovário. Nota: Critetapa ica: incisão da pele preciso facilita a cura de feridas, a utilização de um bisturi é recomendada na etapa 2.4. Usando uma pinça fina sem corte puxar a almofada de gordura ovário cuidadosamente através da incisão em direção à linha média, minimizando danos aos nervos e vasos sanguíneos principais. Passo Crítico: Se ocorrer sangramento, pare a cirurgia e considerar o transplante de um animal hospedeiro diferente. Sob o controlo do microscópio de dissecção com a ajuda de uma agulha de calibre 28 chanfrada fazer uma incisão de 2-4 mm de profundidade dentro da almofada de gordura dos ovários, 3-4 mm acima do ovário. passo crítico: Certifique-se que a incisão única atravessa metade da camada de gordura; perfurando todo o caminho até a parte inferior faz com que o vazamento. Seja rápido e proceder sem demora após esta etapa. Para transplantes de células, encher uma seringa (agulha de calibre 30) com 10-20 ul da membrana matriz de mistura de células-cave e injetar na incisão almofada de gordura. Para transplante tuba uterina, pegar a sagacidade tuba uterinah pinça fina e coloque em 10 – matriz de membrana basal 20 l mantido em gelo. Usando um 0,1-10 / 20 l XL formou ponta de filtro (encurtado em 3 mm) pegar a suspensão matriz de tecido e membrana basal e solte na incisão almofada de gordura. Esperar 5 minutos para a matriz da membrana basal para solidificar e colocar o aparelho reprodutor de volta para o peritoneu. Feche os músculos com 2 stiches de sutura cirúrgica e a pele com dois clipes pequena ferida ou sutura cirúrgica. Repita os passos de 2,4-2,8 para transplantar uma matriz de mistura de membrana PBS-cave na almofada de gordura contra-lateral do animal que servirá como controle. passo crítico: Após a cirurgia colocar o animal numa almofada de aquecimento, porque a perda de calor é rápida, em ratos anestesiados. Vamos animais recuperar em uma almofada de aquecimento na gaiola nativa e observar o animal até totalmente acordado da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter esternosl decúbito. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Coloque um punhado de peletes alimentares pré-molhados no interior da gaiola para além secar os alimentos na gaiola após a cirurgia. Aplicar analgésicos pós-cirúrgicas, se necessário para os próximos dias e examinar a ferida diariamente. Aplicar antibióticos de acordo com o protocolo de animais aprovados se infecção da ferida ocorre. Remover grampos de feridas 10 dias após a cirurgia, quando a ferida foi totalmente fechada. 3. Histologia e Aquisição de Imagem Coleção do enxerto e Preservação Preparar solução de paraformaldeído a 4% por mistura de 26 ml ddH2O com 4 ml de PBS 10X e 10 ml de solução de paraformaldeído a 16%. Dissecar em um bloco, o bloco enxertados ovário gordura, ovário, trompa uterina, 0,5 centímetros útero, tal como descrito nos passos 1.1.1-1.1.4. Colocar imediatamente em 2 ml de 4% de paraformaldeído e fixar durante 2 h, à TA. A partir do mesmo animal, dissecar o não-enxertadoscontralateral sistema de almofada de gordura ovário transplantado com a mistura de matriz de membrana PBS-cave como um controle (veja o passo 2.9). Fix e processo da mesma forma. Após lavagem fixação tecidos três vezes com PBS durante 5 min e incubar durante a noite em PBS a 4 ° C. Para todo o monte a imagem da camada de gordura ovário avançar para o passo 3.2.1. Nota: Depois de os tecidos de aquisição de imagem pode ser congelada (3.3.1) ou processados ​​para inclusão em parafina (3.3.2). incubação durante a noite em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C melhora a qualidade de tecidos congelados. Aquisição de imagem O lugar todo-montar sistemas de almofada de gordura ovarianos em pratos PBS cheios e imagem usando um microscópio invertido equipado com o acessório de epi-fluorescência e câmera colorida de alta definição, com 4, 10x objetivos e um estereomicroscópio equipado com um acessório de fluorescência, câmera colorida e Plano Apo 1xWD70, objectivos ED Plano 1.5xWD45. Histologia Segueaquisição de imagem todo-mount (3.2.1) coloque uma gota 200-500 mL de incorporar meio de amostras de tecidos congelados em um pedaço 2 x 1 cm de filme de laboratório e usando uma pinça, transferir o tecido para a queda. Pegar o filme em uma borda e transferir a gota tecido de médio para um frasco criogênico ml 1.8. Feche o frasco e mergulhar em azoto líquido. Armazenar tecidos congelados a -80 ° C. Como alternativa, proceder à inclusão em parafina padrão. Use 20-40 volumes de volume de tecido, para cada passo. Imergir tecidos uma vez em etanol a 65% durante 30 min, agitando suavemente à TA. Imergir tecidos uma vez em etanol a 70% durante 30 min, agitando suavemente à TA. Nesta fase, as amostras podem ser armazenadas durante meses à TA. Imergir tecidos uma vez em etanol a 90% durante 30 min, agitando suavemente à TA. Imergir tecidos uma vez em etanol a 95% durante 30 min, agitando suavemente à TA. Imergir tecidos duas vezes em etanol absoluto (200 prova) durante 30 min, agitando suavemente à TA. <li> Imergir tecidos duas vezes em clorofórmio, durante 30 min, agitando suavemente à TA. Mergulhar uma vez que os tecidos em parafina, durante 30 min, agitando suavemente a 58 ° C. Mergulhe tecidos vez em parafina para 12 horas, agitando a 58 ° C. Mergulhar uma vez que os tecidos em parafina, durante 3 h, a 58 ° C. Coloque tecidos em moldes de histologia de metal e encher moldes com 58 ° C de parafina. Adicionar uma cassete de histologia de plástico no topo da parafina arrefecer e parafina para 4 ° C. Extraia bloco de parafina de tecido e armazenar a RT. Nota: Parafina temperatura não deve exceder os 58 ° C durante a preservação óptima de tecido adequado para coloração imuno-histoquímica. Alternativamente, Prepare-se para o Parafina com Gel processamento das amostras. Aspirar o PBS e transferir tecidos Todo-mount a 70% de etanol. Incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Em um banho de água, a amostra de pré-aquecimento para o processamento de gel de 60 ° C. pipetae 200 ul de gel de processamento de espécimes sobre uma placa de Petri de laboratório filme forrado. Utilizando uma pinça de dissecção fina transferir o sistema de tecido todo-mount à queda espécime de gel de processamento. Permitir que a amostra tampão de gel de processamento a solidificar à temperatura ambiente, ou solidificar o tampão durante 10 min a 4 ° C. Colocar o tecido embebido em gel de processamento de espécimes em cassetes de tecido ensanduichada entre a histologia de biópsia almofadas de espuma. Incorporar em parafina como nos passos 3.3.2-3.3.2.10. Nota: Specimen processamento incorporação gel evita a perda e permite a preservação de amostras de tecidos frágeis pequenas. Nota: Os tecidos congelados ou inclusão em parafina são adequados para coloração imuno-histoquímica 14,15.