마우스 난소 지방 패드 속으로 이식

설명 된 모든 생체 내 작품은 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된다. 난소 지방 패드 시험 법 1. 샘플 준비 분리 및 문화 차의 두발 상피 (TE) 세포 CO에 의해 8 주령 처녀 β – 굴지 – 강화 된 녹색 형광 단백질 (EFGP) 또는 β-액틴 Discosoma 붉은 형광 단백질 (을 DsRed) 마우스에 자궁 경부 전위 다음이 관리 기증자 6- 안락사. 발가락 핀치에 의해 성공적으로 안락사를 확인합니다. 흡수 드레이프, 복부 쪽이 위로에 개별 마우스를 놓은 다음 70 % 에탄올로 복부를 닦아냅니다. 신체 중앙선에서 횡 절개함으로써 손가락 끝 위에서 마우스의 머리와 꼬리쪽으로 절개 아래의 피부를 당기로 피부를 연다. 무딘 집게를 사용하여 복막을 잡고 체강을 열 미세 가위로 절단을합니다. 조심스럽게 intestin의 코일을 밀어옆으로 전자 및 생식 기관을 찾습니다. 미세 집게로 한 자궁 경적을 선택하고 자궁 뿔이 분리 점 이상 0.5 cm를 잘라. 자궁 경적을 누른 상태에서, 결합 자궁 뿔에 부착 조직, 자궁 관 난소와 난소 지방 패드를 멀리 해부하다. 6 ml의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 함께 접시에 해부 생식 기관을 배치합니다. 두 번째 생식 기관을 진행합니다. 바이오 안전성 캐비닛에 접시를 전송하고 멸균 PBS 6 ml의 조직을 3 회 씻는다. 바이오 안전성 캐비닛에있는 해부 현미경 작업을 계속합니다. 미세 핀셋 자궁 뿔을 잡아와 자궁 – 난관 접합부에서 절단하여 자궁 관에서 자궁 경적을 분리합니다. 25 G 바늘을 사용하여 난소를 둘러싼 난소 점액낭을 잘라. 주 : 점액낭 난소가 제거 된 후, 박리가 완료되고 개개의 자궁 관의 PBS 용액에 남아있다. 자장하게 이동3.5 cm 접시에 PBS의 50 μl의 강하 전자 자궁 튜브와 28 게이지 바늘을 사용하여 0.1 mm 조각으로 말하다. 200 μL 소화 버퍼 1 (둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM) F12이 (햄) 매체가 300 단위 ml의 -1 콜라게나 100 단위 ml의 -1 히알루로 보충) 및에 전송 5 % CO에서 37 ° C에서 1 시간 동안 배양 2 배양기. 배양 후, 1 ml의 0.25 %의 트립신 – 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가하고 1 ML의 피펫 팁 (일명 블루 팁) 3 분간 20 배의 도움으로 솔루션을 일시 중지합니다. (햄) 매체는 2 % 소 태아 혈청을 포함하는 5 ml의 + 4 ° C DMEM / F12를 추가합니다. ((햄) 매체는 7 밀리그램 ml의 -1 스파 아제 (Dispase) II 10 μg의 ml의 -1 디옥시리보 뉴 클레아 제 I 보충 원심 분리 (600 RCF, 5 분, 실온 (RT))에 의해 조직을 수집하고 1 ML의 소화 버퍼 2 (DMEM의 F12를 추가 DNase의의 I)). 1 ml를 피펫 TI의 도움으로 조직 펠렛을 20 회 일시 중단피. 5 ml의 무 혈청 완전한 마우스 난관 상피 세포 성장 매체 (M-TE-GM, 표 1)를 추가합니다. 원심 분리하여 세포 (600 RCF, 5 분, RT)을 수집합니다. 일시 중지 및 혈구로 세포를 계산, 1 ml의 M-TE-GM을 추가합니다. 종자 1 × 10 5 24 웰 낮은 부착 판에 웰 당 1 ml의 세포 4 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 M-TE-GM에 품어. 매일 매체를 변경합니다. β – 액틴 EGFP 또는 β-액틴을 DsRed 쥐에서 배양 차 서스펜션 TE 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 24도 낮은 부착 판에서 TE 서스펜션 문화를 수집합니다. 1 ml의 0.25 % 트립신 – EDTA와 원심 분리기 (600 RCF, 5 분, RT) 및 일시 중단 세포 펠릿. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션. 5 ㎖의 DMEM / F12 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 (햄) 배지를 첨가함으로써 트립신 활성을 멈춘다. 원심 분리 (600 RCF, 5 분, RT)에 의해 세포 알약을 수집합니다. 세척 세포 펠렛을 두 번 차가운 PBS (4 ° C)의 4 ㎖로, 세포 펠렛 당 1 ml의 PBS를 추가하고 일시 중지합니다. 혈구에 의해 세포를 계산 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 전송할 수 있습니다. 얼음에서 작업, 10 ㎕의 PBS에 1 × 10 5 세포를 추가 한 후 10 μl의 기저막 행렬을 추가합니다. 일시 중지 및 동물의 방에 얼음 운반 할 것. 참고 : 무균 조건 하에서 바이오 안전성 캐비닛에있는 모든 해부 및 조직 문화 작업을 수행합니다. 불멸화 된 인간 세포주의 제조 별도로 성장 렌티 바이러스-EGFP 및 -mCherry 표시 인간의 불후의 난소 표면 상피 세포 lineHIO118 80까지 – 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10cm 요리에 90 % 포화 상태. 10 ml의 PBS로 두 번 설거지, 접시 당 1 ml의 0.25 %의 트립신 – EDTA를 추가하고 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 10 ㎖의 DMEM / F12 5 % 소 태아 혈청을 함유하는 (햄) 배지를 첨가하여 반응을 정지. 수집원심 분리하여 세포 펠렛 (600 RCF, 5 분, RT). 세척 세포 펠렛을 두 번 차가운 PBS (4 ° C) 10 ㎖로, 세포 펠렛 당 1 ml의 PBS를 추가하고 일시 중지합니다. 혈구에 의해 세포를 계산 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 전송할 수 있습니다. 얼음에서 작업, 1.0 × 10 6 렌티 – mCherry 표시 셀 + 1.0 × 10 6 렌티-EGFP 10 μl의 PBS로 세포를 표지에 추가합니다. 10 μl의 기저막 행렬을 추가합니다. 일시 중지 및 동물의 방에 얼음 운반 할 것. 자궁 튜브의 제조 1.1.1-1.1.5 단계에 설명 된대로 6에서 PBS에서 8 주 이전 처녀 β – 액틴을 DsRed 마우스 개별 자궁 튜브를 해부하다. 해부 현미경 PBS의 200 μL 드롭으로 하나의 자궁 튜브를 전송합니다. 부드럽게 mesosalpinx, 자궁 관의 세그먼트를 지원하는 폭 넓은 인대의 일부를 제거하여 핀셋, 28 게이지 주사 바늘의 도움으로 자궁 관 풀다. (2)의 드롭 단일 uncoiled 자궁 튜브를 배치00 μl의 얼음처럼 차가운 PBS받는 사람의 난소 지방 패드가 노출 이식을받을 준비가 될 때까지. 2. 난소 지방 패드 이식 참고 : 각 동물 수술 사이에 악기를 소독. 준비하고 사전에 모든 장비를 배치. 이 비장를 방지로 오른쪽 난소 지방 패드 등의 이식이 우선이다. 그러나받는 사람은 모두 난소 지방 패드에 이식을 가질 수있다. 동계 마우스 또는 일차 전지의받는 등 심한 결합 된 면역 결핍 (SCID / NCR) 마우스를 사용합니다. 인간의 세포와 같은 HIO118 세포를 사용 놋 / SCID / 감마 (NSG) 마우스 나 SCID 마우스하십시오. 0.15 ml / 10 g 체중의 투여 량 2,2,2- Tribromoethanol 단일 복강 내 주사로받는 마우스를 마취. 동물 후드, 가열 패드에있는 동물을 놓고 페달 반사 (발가락 핀치)의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 그동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용동물 마취입니다. 수술 – 후 통증 치료 4 밀리그램 / g 체중의 투여 량에서 진통 케토 프로 펜과 동물의 피하에 주입한다. 참고 : 다른 방법으로 마취에 대한 이소 플루 란을 사용합니다. 유도 챔버에 놓고, 동물 0.8-1.5 L / 분, 2-3 %로 이소 플루 란 기화기에 산소 유량계를 조정한다. 챔버에서 마취 동물을 제거 후 수술을 시작, 마스크에서 이소 플루 란을 흡입 및 0.4-0.8 L / 분 1.5 %로 이소 플루 란 기화기에 산소 유량계을 설정할 수 있습니다. # 40 가위로 수술 영역을 면도; , 영역에서 두 배의 외과 영역 모발 제거 70 % 에탄올 다음 포비돈 요오드 세 살균 수술과 면도 된 피부를 준비하고 멸균 드레이프 커버. 바이오 안전성 캐비닛에있는 해부 현미경으로 동물을 이동합니다. 직접 난소 지방 패드 위의 dorsomedial 위치에 절개하여 생식 기관을 노출. 참고 : 치명타iCal의 단계 : 정확한 피부 절개는 상처 치유를 촉진은 메스의 사용 단계 2.4 권장합니다. 사용 무딘 미세 집게는 신경 및 주요 혈관의 손상을 최소화 조심스럽게 중간 선으로 절개를 통해 난소 지방 패드를 당깁니다. 중요한 단계 : 출혈이 발생하면, 수술을 중단하고 다른 숙주 동물에게 이식을 고려한다. 28 게이지 경 바늘의 도움으로 해부 현미경의 제어하에 난소 지방 패드로 2-4mm 깊은 절개, 난소 위 3-4mm합니다. 중요한 단계 : 절개 만 지방 패드의 절반을 통과 있는지 확인; 바닥면까지 줄곧 천공하여 누설을 야기한다. 신속하고이 단계 후 지체없이 진행합니다. 세포 이식의 경우, 세포 기저막 매트릭스 혼합물을 10 내지 20 μL의 주사기 (30 게이지 니들)을 채우고 지방 패드에 주입 절개. 자궁 관 이식의 경우, 자궁 관 재치를 데리러시간 미세 집게와 10 위 – 20 μl의 기저막 행렬은 얼음에 보관. 0.1 / 20 μl를 사용 XL (3 mm 정도 단축) 필터 팁 조직 및 기저막 매트릭스 정지를 픽업하여 지방 패드 절개로 해제를 졸업했다. 기저막 행렬이 응고 다시 복막에 생식 기관을 배치하는 5 분 정도 기다립니다. 이 수술 봉합의 stiches와 두 개의 작은 상처 클립이나 수술 봉합사로 피부와 근육을 닫습니다. 반복 제어 될 것 동물의 콘트라 측면 지방 패드에 PBS-기저막 매트릭스 혼합물을 이식 2.4-2.8 단계를 반복합니다. 중요한 단계 : 열 손실은 마취 된 쥐의 급격한 때문에 수술 후, 가열 패드에 동물을 배치합니다. 동물 네이티브 장에 가열 패드에 복구하고 마취에서 완전히 깨어 때까지 동물을 관찰 할 수 있습니다. 이 sterna을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오리터로 누워. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 수술 후 케이지에 음식을 건조뿐만 아니라 케이지 내부에 미리 젖은 음식 펠렛의 소수를 놓습니다. 다음 몇 일 동안 필요한 경우 수술 후 진통제를 적용하고 매일 상처를 검사합니다. 창상 감염이 발생하는 경우 승인 된 동물 프로토콜에 따라 항생제를 적용합니다. 상처가 완전히 폐쇄되면 수술 후 상처 클립 10 일 제거합니다. 3. 조직학 및 이미지 인식 이식 수집 및 보존 4 ml의 10 배 PBS 10 ml의 16 % 파라 포름 알데히드 용액으로 26 ML의 DDH 2 O를 혼합하여 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 제조 하였다. 하나의 블록에 접목 난소 난소 지방 패드, 자궁 관, 1.1.1-1.1.4 단계에 설명 된대로 0.5 cm의 자궁을 해부하다. 즉시 2 ml의 4 % 파라 포름 알데히드에 배치하고 실온에서 2 시간 동안 고정한다. 동일한 동물로부터 비 접목 해부대조군으로서 PBS-기저막 매트릭스 혼합물을 이식 반대측 난소 지방 패드 시스템 (단계 2.9 참조). 수정과 동일한 방식으로 처리. 정착 세척 후 5 분 동안 PBS로 3 회 조직 및 4 ℃에서 PBS에서 밤새 배양한다. 난소 지방 패드의 전체 마운트 이미징 3.2.1 단계로 진행합니다. 참고 : 이미지 수집 조직이 얼 수 후 (3.3.1) 또는 파라핀 포함 (3.3.2)에 대한 처리. 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당의 하룻밤 배양 냉동 조직의 품질을 향상시킵니다. 이미지 획득 형광 첨부 컬러 카메라와 플랜 갖춘 4 배 목적 및 실체와 에피 형광 부착 고화질 컬러 카메라 장착 PBS 가득 요리 거꾸로 현미경을 사용하여 화상 난소 지방 패드 시스템 – 온 탑재 장소 아포 1xWD70, ED 계획 1.5xWD45 목표. 조직학 수행원전체 마운트 이미지 수집 (3.2.1) 실험 영화와 집게를 사용하는 2 × 1cm의 조각에 냉동 조직 표본에 대한 매체를 포함하는 200 ~ 500 ㎕를 드롭 배치, 드롭에 조직을 전송합니다. 하나의 가장자리에 필름을 들고 1.8 ml의 극저온 유리 병에 조직 매체 드롭을 전송합니다. 유리 병을 닫고 액체 질소에 뛰어 들다. -80 ° C에서 냉동 조직을 저장합니다. 또한, 표준 파라핀 삽입 진행합니다. 각 단계에 대한 조직 부피의 20 ~ 40 볼륨을 사용합니다. 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번 65 % 에탄올에 담가 조직. 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분 동안 한 번에 70 % 에탄올에 조직을 담가. 이 단계에서 샘플 RT에서 개월 동안 저장 될 수있다. 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번 90 % 에탄올에 담가 조직. 실온에서 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 한번, 95 % 에탄올에 담가 조직. 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분 동안 두 번 무수 에탄올 (200 증거)에 조직을 담가. <리> 실온에서 부드럽게 흔들어 30 분간 클로로포름에 두 번 조직을 담가. 58 ° C에서 부드럽게 흔들어 30 분간 파라핀에 한 번 조직을 담가. 58 ° C에서 부드럽게 흔들면서 12 시간 동안 파라핀에 한 번 조직을 담가. 58 ° C에서 3 시간 동안 파라핀에 한 번 조직을 담가. 금속 조직학 금형에 조직을 배치하고 58 ° C 파라핀와 금형을 입력합니다. 파라핀의 상단에 플라스틱 조직학 카세트를 추가하고 4 ℃로 파라핀을 냉각. RT에서 파라핀 조직 블록 및 저장의 압축을 풉니 다. 참고 : 파라핀의 온도가 면역 조직 화학 염색에 적합한 조직의 최적의 보전을 위해 58 ° C를 초과하지 않아야한다. 또한, 표본 처리 젤과 파라핀 포함]를 준비합니다. PBS를 대기음 및 70 % 에탄올로 전체 마운트 조직을 전송합니다. 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. 수조에서 예열 시험편을 60 ℃로 겔을 처리하는 단계를 포함한다. PipettE 실험실 필름 늘어선 페트리 접시 위에 시료 처리 겔 200 μL. 사용하여 미세 해부 집게는 시편 처리 겔 드롭에 전체 마운트 조직 시스템을 전송합니다. 시험편 가공 겔​​ 플러그 실온에서 고화, 4 ° C에서 10 분 동안 플러그를 고체화 할 수있다. 조직 검사 폼 패드 사이에 끼워 조직학 조직 카세트에서 시료 처리 겔 포함 된 조직을 놓습니다. 단계 3.3.2-3.3.2.10과 파라핀에 포함. 참고 : 시료 처리 젤 삽입 손실을 방지하고 작은 깨지기 쉬운 조직 샘플을 보존 할 수 있습니다. 참고 : 냉동 또는 파라핀 삽입에 의해 보존 된 조직이 면역 조직 화학 염색 14, 15에 적합하다.