Transplantation in die Maus Ovarian Fat Pad

Alle die in vivo-Arbeit beschrieben wird von der Cornell University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Probenvorbereitung für Ovarian Fat Pad Assays Isolierung und Kultur von primären Tubal Epithels (TE) Zellen Euthanize Donator 6- bis 8-Wochen alten virgin β-Actin-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) oder β-Actin-Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) Mäuse durch CO 2 Verabreichung durch zervikale Dislokation gefolgt. Überprüfen der erfolgreichen Euthanasie durch eine Zehe Prise. Legen Sie eine einzelne Maus auf einem saugfähigen Tuch, Bauchseite nach oben, und dann wischen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Haut durch einen seitlichen Schnitt am Körper Mittellinie zu machen und mit den Fingerspitzen ziehen die Haut über und unter dem Schnitt in Richtung der Kopf und Schwanz der Maus. Halten Sie das Peritoneum stumpfen Pinzette und einen Schnitt mit einer feinen Schere, um die Körperhöhle zu öffnen. Schieben Sie die Spule des intestine zur Seite und die Fortpflanzungsorgane finden. Mit einer feinen Pinzette abholen ein Uterushorn und geschnitten 0,5 cm über dem Punkt, wo die Gebärmutterhörner trennen. Während das Uterushorn hält, sezieren entfernt an der Gebärmutterhorn befestigt Bindegewebe, Eileiter, Eierstock- und ovarian Fettpolster. Platzieren seziert Reproduktionstrakts in einer Schale mit 6 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Fahren Sie mit dem zweiten Reproduktionstrakt. Die Schale in einem Biosafety Schrank und waschen Sie die Gewebe 3 mal in 6 ml sterilem PBS. Fortsetzung der Arbeit unter einem Präpariermikroskop im Schrank Biosafety befindet. Besorgen Sie sich die Uterushorn mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie das Uterushorn von der Eileiter durch an der utero-tubal Kreuzung Trennen. Schneiden Sie die ovarian Schleimbeutel die Ovar umgeben von einer 25 G Nadel. Hinweis: Nach der ovarian Schleimbeutel entfernt worden ist, die Präparation abgeschlossen ist und die einzelnen Eileiter verbleibt in der PBS-Lösung. Übertragen einer single Eileiters in einem 50 ul Tropfen PBS auf eine 3,5-cm-Schale und Hackfleisch in 0,1 mm Stücke mit 28 Gauge Nadeln. Transfer auf 200 & mgr; l Verdauungspuffer 1 (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) , F12 (Ham) Medium , ergänzt mit 300 Einheiten ml -1 Kollagenase und 100 Einheiten ml -1 Hyaluronidase) und bei 37 ° C in einer 5% CO 1 h inkubieren 2 Inkubator. Nach der Inkubation mit 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und die Lösung mit Hilfe einer 1 ml-Pipettenspitze (aka blaue Spitze) 20-mal für 3 Minuten auszusetzen. 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 (Ham) -Medium, das 2% fötales Rinderserum. Sammeln Sie Gewebe durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, Raumtemperatur (RT)) und 1 ml Verdauungspuffer 2 (DMEM F12 (Ham) Medium , das mit 7 mg ml -1 Dispase II und 10 ug ml -1 Deoxyribonuclease I ( DNase I)). Suspend Gewebepellet 20-mal mit Hilfe einer 1 ml Pipette tiSeite 5 ml Serum frei komplette Maus tubal Epithel-Wachstumsmedium (M-TE-GM, Tabelle 1). Sammle die Zellen durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, RT). 1 ml M-TE-GM, zu suspendieren und zählen Zellen durch Hämocytometer. Seed 1 x 10 5 Zellen in 1 ml pro Vertiefung in einer 24-Well niedrige Befestigungsplatte und bebrüten in M-TE-GM bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 4 Tage. Wechseln Sie jeden Tag das Medium. Bereiten Einzelzellsuspensionen von kultivierten primären Suspension TE – Zellen aus β-Actin-EGFP oder β-Actin-DsRed Mäusen. Sammeln Sie TE Suspensionskulturen von 24-Well-niedrige Befestigungsplatten. Zentrifuge (600 rcf, 5 min, RT) und suspendieren Zellpellets mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA. In einer 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 10 min inkubieren. Trypsin-Aktivität zu stoppen durch Zugabe von 5 ml DMEM / F12 (Ham) Medium, das 5% fötales Rinderserum. Sammeln Zellpellets durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, RT). Wash Zellpellets zweimal mit 4 ml kaltem PBS (4 ° C), 1 ml PBS pro Zellpellet, auszusetzen. Zählen von Zellen durch Hämocytometer und Transfer zu 1,7 ml Zentrifugenröhrchen. Arbeiten auf Eis, fügen Sie 1 x 10 5 Zellen bis 10 & mgr; l PBS, fügen Sie dann 10 ul Basalmembranmatrix. Suspend und Transport auf Eis Tierraum. Hinweis: Führen Sie alle Dissektion und Gewebekulturarbeit in einem Biosafety Schrank unter sterilen Bedingungen. Herstellung von immortalisierten humanen Zelllinie 90% Konfluenz auf 10 cm Geschirr bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator – Lentivirus-EGFP und -mCherry markierten menschlichen verewigte Ovarialoberfläche Epithelzelllinien lineHIO118 bis 80 separat wachsen. Geschirr spülen zweimal mit 10 ml PBS, 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Schale und Inkubation für 10 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Die Reaktion durch Zugabe von 10 ml DMEM / F12 (Ham) Medium, das 5% fötales Rinderserum. SammelnZellpellets durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, RT). Waschzellpellets zweimal mit 10 ml kaltem PBS (4 ° C), 1 ml PBS pro Zellpellet und suspendieren. Zählen von Zellen durch Hämocytometer und Transfer zu 1,7 ml Zentrifugenröhrchen. Arbeiten auf Eis, fügen Sie 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry markierten Zellen + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP – Zellen zu 10 & mgr; l PBS markiert. Fügen Sie 10 & mgr; l Basalmembran-Matrix. Suspend und Transport auf Eis Tierraum. Herstellung des Eileiters Sezieren einzelne uterine Rohre von 6 bis 8 Wochen alte virgin β-Actin-DsRed Mäuse in PBS wie in Schritten 1.1.1-1.1.5 beschrieben. Übertragen Sie einzelne Eileiter in einen 200 & mgr; l Tropfen PBS unter einem Präpariermikroskop. Sanft abrollen Eileiter mit Hilfe von Pinzetten und 28 Gauge-Nadeln durch die mesosalpinx Entfernen eines Teils des breiten Band, das die Segmente des Eileiters unterstützt. Legen Sie einzelne abgewickelte Eileiter in einem Tropfen 200 & mgr; l eiskaltem PBS, bis die ovarian Fettpolster des Empfängers wird freigelegt und vorbereitet, um die Transplantation zu erhalten. 2. Ovarian Fat Pad Transplantation Hinweis: Desinfizieren Instrumente zwischen den einzelnen Tierchirurgie. Bereiten Sie und alle Geräte im Voraus vereinbaren. Dorsal Transplantationen nach rechts ovarian Fettpolster sind bevorzugt, da dies die Milz vermeidet. Jedoch können die Empfänger-Transplantationen in beiden ovarian Fettpolster haben. Verwenden Sie syngene Mäuse oder schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID / NCR) Mäuse als Empfänger von Primärzellen. Für menschliche Zellen, wie HIO118 Zellen, Verwendung NOD / SCID / gamma (NSG) Mäusen oder SCID-Mäusen. Empfänger-Maus mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von 2,2,2-Tribromethanol in einer Dosierung von 0,15 ml / 10 g Körpergewicht anästhesiert. Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, im Tier Haube und überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch den Verlust der Pedal Reflex (toe Prise). Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit zu verhindern, während dieTier unter Narkose. Spritzen Sie das Tier subkutan mit dem Analgetikum Ketoprofen in einer Dosis von 4 mg / g Körpergewicht für postoperative Schmerzen zu behandeln. Hinweis: Als Alternative Isofluran zur Anästhesie verwendet werden. Legen Sie das Tier in der Induktionskammer und stellen Sie den Sauerstoff-Durchflussmesser auf 0,8 bis 1,5 l / min und der Isofluran-Verdampfer auf 2-3%. Entfernen Sie die narkotisierten Tier aus der Kammer, lassen Sie es Isofluran von einer Maske atmen und stellen Sie den Sauerstoff-Durchflussmesser auf 0,4 bis 0,8 l / min und der Isofluran-Verdampfer auf 1,5%, dann die Operation beginnen. Shave den OP-Bereich mit # 40 Clippers; entfernen Haare aus einem Gebiet, 2-fache der OP-Bereich, bereiten Sie die rasierte Haut mit drei antiseptisch scheuert von PVP-Jod, um 70% Ethanol gefolgt, und die Abdeckung mit einem sterilen Tuch. Bewegen Sie das Tier unter einem Präpariermikroskop in einem Biosafety-Schrank. Setzen Sie die Fortpflanzungsorgane durch einen Einschnitt in der dorsomedial Position direkt über dem ovarian Fettpolster. Hinweis: Critische Schritt: Precise Hautinzision Wundheilung erleichtert, ist die Verwendung eines Skalpells in Schritt 2.4 empfohlen. Mit stumpfen feinen Pinzette ziehen Sie den ovarian Fettpolster vorsichtig durch den Schnitt in Richtung der Mittellinie, minimiert Schäden an Nerven und großen Blutgefäße. Critical Schritt: Wenn die Blutung auftritt, die Operation zu stoppen und prüfen, zu einem anderen Wirtstier Umpflanzen. Unter der Kontrolle des Mikroskops Dissektion mit Hilfe einer 28 Gauge Nadel eine abgeschrägte 2-4 mm tiefen Einschnitts in das Fettpolster ovarian machen, 3-4 mm oberhalb des Ovars. Kritischer Schritt: Stellen Sie sicher, dass der Schnitt nur durch die Hälfte des Fettpolsters geht; den ganzen Weg durch Punktierung auf der Unterseite führt zu Leckagen. Seien Sie schnell und gehen unverzüglich nach diesem Schritt. Für Zelltransplantationen, eine Spritze (30-Gauge-Nadel) mit 10-20 ul der Zell-Basalmembranmatrix-Mischung füllen und in die Fettpolster Einschnitt injizieren. Für Eileiters Transplantation, die Eileiter wit abholenh feinen Pinzette und in 10 – 20 & mgr; l Basalmembranmatrix auf Eis gehalten. Mit Hilfe eines 0,1-10 / 20 ul XL Verlaufsfilter Spitze (verkürzt von 3 mm), um das Gewebe und Basalmembranmatrix Suspension aufzunehmen und die Freisetzung in die Fettpolster Einschnitt. 5 Minuten warten für die Basalmembranmatrix zu verfestigen und legen Sie den Reproduktionstrakt zurück in das Peritoneum. Schließen Sie die Muskeln mit 2 Stichen von chirurgischem Naht und die Haut mit zwei kleinen Wundklammern oder chirurgische Naht. Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,8 eine PBS-Basalmembranmatrix-Gemisch in den kontralateralen Fettpolster des Tieres zu verpflanzen, die als Kontrolle dienen. Critical Schritt: Nach der Operation stellen das Tier auf einem Heizkissen, weil der Wärmeverlust rasch in narkotisierten Mäusen ist. Lassen Tier auf einem Heizkissen in der nativen Käfig erholen und das Tier beobachten aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten sterna wiedergewonnen hatl recumbence. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt. Legen Sie eine Hand voll vorbefeuchtenden Futterpellets in den Käfig zusätzlich Nahrung auf dem Käfig nach der Operation, um zu trocknen. Bewerben postoperativen Analgetika, wenn für die nächsten paar Tage benötigt und die Wunde täglich untersuchen. Bewerben Antibiotika gemäß dem genehmigten Tier-Protokoll, wenn Wundinfektion auftritt. Entfernen Wundklammern 10 Tage nach der Operation, wenn die Wunde vollständig geschlossen ist. 3. Histologie und Image Acquisition Graft Sammlung und Erhaltung Herstellung von 4% Paraformaldehyd – Lösung durch Mischen von 26 ml ddH 2 O mit 4 ml 10x PBS und 10 ml 16% Paraformaldehyd – Lösung. Präparieren in einem Block, der transplantierten ovarian Fettpolster, Ovar, Eileiter, 0,5 cm Uterus wie in den Schritten 1.1.1-1.1.4. Unmittelbar danach ist in 2 ml 4% Paraformaldehyd und fixieren 2 h bei RT. Aus dem gleichen Tier, sezieren die nicht-transplantiertenkontralaterale ovarian System Fettpolster transplantiert mit PBS-Basalmembranmatrix Mischung als Kontrolle (siehe Schritt 2.9). Fix und Verfahren in der gleichen Weise. Nach der Fixierung Wasch Geweben dreimal mit PBS für 5 Minuten und über Nacht in PBS bei 4 ° C inkubiert. Für das Gesamtmontage Abbildung des ovarian Fettpolster gehen 3.2.1 Schritt. Anmerkung: Nachdem die Bildaufnahme Gewebe eingefroren werden kann (3.3.1) oder für Paraffineinbettung verarbeitet werden (3.3.2). Inkubation über Nacht in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C verbessert die Qualität von gefrorenem Gewebe. image Acquisition Legen Sie ganzes Montage ovarian Fettpolster Systeme in PBS gefüllten Schalen und Bild ein umgekehrtes Mikroskop ausgestattet mit Epi-Fluoreszenz-Befestigung und High-Definition-Farbkamera mit 4, 10x Zielen und einem Stereomikroskop mit einem Fluoreszenzaufsatz ausgestattet, Farbkamera und Plan Apo 1xWD70, ED-Plan 1.5xWD45 Ziele. Histologie folgendeganze-mount Bildaufnahme (3.2.1) legen Sie ein 200-500 ul Tropfen Medium für gefrorene Gewebeproben auf einem 2 x 1 cm großes Stück Laborfolie und mit einer Pinzette zum Einbetten, übertragen das Gewebe auf den Rückgang. Nehmen Sie den Film an einer Kante und übertragen die Gewebe-Medium Tropfen zu einem 1,8 ml Kryo-Fläschchen. Schließen Sie das Fläschchen und tauchen Sie ein in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie gefrorene Gewebe bei -80 ° C. Alternativ fahren Sie mit dem Standard-Paraffineinbettung. Verwenden 20-40 Volumina Gewebevolumen für jeden Schritt. Tauchen Sie einmal Gewebe in 65% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. Tauchen Sie einmal Gewebe in 70% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. In diesem Stadium können die Proben für Monate bei RT gelagert werden. Tauchen Sie einmal Gewebe in 90% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. Tauchen Sie einmal Gewebe in 95% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. Tauchen Gewebe zweimal in absolutem Ethanol (200 Proof) für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. <li> Tauchen zweimal Gewebe in Chloroform für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. Tauchen Sie einmal Gewebe in Paraffin für 30 min unter leichtem Schütteln bei 58 ° C. Tauchen Sie einmal Gewebe in Paraffin für 12 Stunden unter leichtem Schütteln bei 58 ° C. Eintauchen, wenn Gewebe in Paraffin für 3 h bei 58 ° C. Legen Sie Gewebe in Metall Histologie Formen und füllen Formen mit 58 ° C Paraffin. Fügen Sie eine Kunststoff-Histologie Kassette auf dem Paraffin und abkühlen Paraffin bis +4 ° C. Extrahieren Paraffin-Gewebeblock und lagern bei RT. Hinweis: Paraffin Temperatur nicht 58 ° C für eine optimale Konservierung von Gewebe für immunohistochemische Färbung geeigneten überschreiten sollte. Alternativ Bereiten Sie für die Paraffinausgießstation mit der Probenverarbeitung Gel. Saugen Sie das PBS und übertragen ganze-mount Gewebe zu 70% Ethanol. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Std. In einem Wasserbad, Verarbeitung vorheizen Probe Gel bis 60 ° C. pipette 200 ul der Probenverarbeitung Gel auf einem Labor Film ausgekleideten Petrischale. Mit feinen Sezierung einer Pinzette übertragen die gesamte Montage Gewebesystem zur Probenverarbeitung Gel Tropfen. Lassen Sie die Probenverarbeitung Gelpfropfen bei Raumtemperatur zu verfestigen oder erstarren den Stecker für 10 min bei 4 ° C. Platzieren Sie die Probenverarbeitung Gel eingebetteten Gewebekassetten Histologie Gewebe zwischen Biopsie Schaumstoffkissen eingeklemmt. Einbetten in Paraffin wie in den Schritten 3.3.2-3.3.2.10. Hinweis: Probenverarbeitung Gel Einbettung verhindert den Verlust und ermöglicht die Erhaltung von kleinen zerbrechlichen Gewebeproben. Hinweis: Die Gewebe durch Gefrieren haltbar gemacht oder Paraffineinbettung zur immunhistochemischen Färbung von 14,15 geeignet sind.