Transplantatie in de muis ovariële vet pad

Al het in vivo werk beschreven, is goedgekeurd door de Cornell University Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Steekproef De voorbereidingen voor ovariële Fat Pad Testen Isolatie en cultuur van de Primary Tubal epitheel (TE) Cellen Euthanize donor 6 tot 8 weken oude virgin β-actine-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) of β-actine-Discosoma rood fluorescent eiwit (DsRed) muizen door CO 2 toediening, gevolgd door cervicale dislocatie. Controleer succesvolle euthanasie door een teen knijpen. Plaats een individuele muis op een absorberend draperen, ventrale kant naar boven, en veeg de buik met 70% ethanol. Open de huid door een laterale snede in het lichaam middellijn en met de vingertoppen trek de huid boven en onder de incisie naar de kop en staart van de muis. Houd het buikvlies met behulp van stompe pincet en maak een snede met fijne schaar om de lichaamsholte te openen. Duw de spoel van de intestine opzij en zoek de voortplantingsorganen. Met fijne tang halen een baarmoeder hoorn en snijd 0,5 cm boven het punt waar de baarmoeder horens te scheiden. Terwijl de baarmoeder hoorn, ontleden weg bindweefsel bevestigd aan de baarmoeder hoorn, eileider, eierstok en ovariële vet pad. Plaats ontleed voortplantingsorganen in een schaal met 6 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Ga verder met de tweede voortplantingsorganen. Breng de schotel naar een bioveiligheid kast en was de weefsels 3 keer in 6 ml steriele PBS. Voortzetting van de werkzaamheden in het kader van een dissectie microscoop in de bioveiligheid kast. Pak de baarmoeder hoorn met fijn pincet en trek de baarmoeder hoorn van de eileider door het doorsnijden van de utero-eileiders kruising. Knip de ovariële bursa rond de eierstok met behulp van een 25 G naald. Let op: Na de ovariële bursa is verwijderd, de dissectie is voltooid en het individuele eileider blijft in de PBS-oplossing. Transfer een single eileider in een 50 ul druppel PBS tot een 3,5 cm schotel en gehakt in 0,1 mm stukken met behulp van 28 gauge naalden. Overdracht aan 200 pi digestie buffer 1 (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) F12 (Ham's) medium aangevuld met 300 eenheden ml -1 Collagenase en 100 eenheden ml -1 hyaluronidase) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator. Na de incubatie, voeg 1 ml 0,25% trypsine-Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en suspendeer de oplossing met behulp van een 1 ml pipetpunt (aka blauwe tip) 20 keer gedurende 3 minuten. Voeg 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 (Ham's) medium dat 2% foetaal runderserum. Verzamel weefsels door centrifugeren (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur (RT)), en voeg 1 ml digestiebuffer 2 (DMEM F12 (Ham's) medium aangevuld met 7 mg ml -1 Dispase II en 10 ug ml-1 Deoxyribonuclease I ( DNase I)). Opschorten weefsel pellet 20 keer met behulp van een 1 ml pipet tip. Voeg 5 ml serum vrij compleet muis eileiders epitheel groeimedium (M-TE-GM, tabel 1). Verzamel cellen door centrifugeren (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur). Voeg 1 ml M-TE-GM, te schorsen en te tellen cellen door hemocytometer. Seed 1 x 10 5 cellen in 1 ml per putje in een 24-well plaat lage hechting en incubeer in M-TE-GM bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 4 dagen. Verander het medium elke dag. Bereid enkele cel suspensies van gekweekte primaire suspensie TE cellen van β-actine-EGFP of β-actine-DsRed muizen. Verzamel TE schorsing culturen uit 24-well laag platen attachment. Centrifuge (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur) en schorten celpellets met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Stop trypsine activiteit door toevoeging van 5 ml DMEM / F12 (Ham's) medium dat 5% foetaal runderserum. Verzamel celpellets door centrifugatie (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur). Wassen celpellets tweemaal met 4 ml koude PBS (4 ° C), voeg 1 ml PBS per celpellet en schorten. Aantal cellen door hemocytometer en transfer naar 1,7 ml buisjes centrifugeren. Werken op het ijs, voeg 1 x 10 5 cellen tot 10 pi PBS, voeg dan 10 ul basaal membraan matrix. Schorten en te vervoeren op het ijs om het dier kamer. Opmerking: Voer alle dissectie en weefselkweek werken in een bioveiligheid kast onder steriele omstandigheden. Bereiding van geïmmortaliseerde humane cellijn Afzonderlijk groeien lentivirus-EGFP en -mCherry gemerkte menselijke geïmmortaliseerde ovariële oppervlak epitheelcel lineHIO118 tot 80-90% confluentie op 10 cm schalen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Afwas tweemaal met 10 ml PBS, voeg 1 ml 0,25% trypsine-EDTA per schaal en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Stop de reactie door toevoeging van 10 ml DMEM / F12 (Ham's) medium dat 5% foetaal runderserum. Verzamelencelpellets door centrifugatie (600 RCF, 5 min, kamertemperatuur). Wassen celpellets tweemaal met 10 ml koude PBS (4 ° C), voeg 1 ml PBS per celpellet en schorten. Aantal cellen door hemocytometer en transfer naar 1,7 ml buisjes centrifugeren. Werken op het ijs, voeg 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry gelabelde cellen + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP gelabelde cellen tot 10 pi PBS. Voeg 10 ul basaal membraan matrix. Schorten en te vervoeren op het ijs om het dier kamer. Voorbereiding van de eileider Ontleden individuele eileiders van 6 tot 8 weken oude virgin β-actine-DsRed muizen in PBS zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.1.5. Transfer één eileiders in een 200 ul druppel PBS onder een dissectie microscoop. Voorzichtig ontrollen eileiders met behulp van een pincet en 28 gauge naalden door het verwijderen van de mesosalpinx, een gedeelte van de brede ligament die de segmenten van de eileider ondersteunt. Plaats één afgewikkeld eileiders in een druppel 200 ul ijskoude PBS tot ovariële vet pad van de ontvanger wordt blootgesteld en bereid zijn om de transplantatie te ontvangen. 2. ovariële vet pad Transplantation Opmerking: Ontsmet instrumenten tussen elk dier chirurgie. Voor te bereiden en te regelen alle apparatuur op voorhand. Dorsale transplantaties naar rechts ovariële vet pad zijn preferentiële als dit voorkomt de milt. Echter, ontvangers transplantaties in zowel ovariële vetkussentjes hebben. Gebruik syngene muizen of ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID / NCR) muizen als ontvangers van primaire cellen. Menselijke cellen, zoals HIO118 cellen, gebruik Nod / SCID / gamma (NSG) muizen of SCID-muizen. Verdoven ontvanger muis met een intraperitoneale injectie van 2,2,2-tribroomethanol in een dosering van 0,15 ml / 10 g lichaamsgewicht. Leg het dier op een verwarmingselement, in de dierenwereld kap en bevestig de juiste verdoving door het verlies van pedaal reflex (teen knijpen). Toepassen dierenarts zalf op de ogen tot droog terwijl voorkomendier onder narcose. Injecteer het dier subcutaan met pijnstillende Ketoprofen in een dosering van 4 mg / g lichaamsgewicht voor de behandeling van postoperatieve pijn. Opmerking: Als alternatief gebruikt isofluraan anesthesie. Plaats het dier in de inductie kamer en pas de zuurstof flowmeter op 0,8-1,5 l / min en de isofluraan vaporizer 2-3%. Verwijder de verdoofde dier uit de kamer, laat het ademen isofluraan van een masker en zet de zuurstof flowmeter tot 0,4-0,8 l / min en de isofluraan vaporizer tot 1,5%, start de operatie. Scheer de chirurgische gebied met # 40 tondeuse; Verwijder het haar van een gebied 2 maal de chirurgische gebied, de voorbereiding van de geschoren huid met drie antiseptische scrubs van povidonjood, gevolgd door 70% ethanol, en dek af met een steriel laken. Verplaats het dier onder een dissectie microscoop in een bioveiligheid kast. Maak de voortplantingsorganen door een incisie in de dorsomediale direct boven de ovariële vetkussentje. Opmerking: Critical stap: Precieze incisie bevordert wondgenezing is het gebruik van een scalpel aanbevolen in stap 2,4. Met behulp van stompe fijne tang trek de ovariële vet pad voorzichtig door de incisie in de richting van de middellijn, het minimaliseren van schade aan de zenuwen en grote bloedvaten. Kritische stap: Als bloeden optreedt, stop de operatie en beschouwen transplanteren naar een andere gastheer dier. Onder besturing van de dissectie microscoop met behulp van een 28 gauge naald afgeschuind maken 2-4 mm diepe snede in de ovariële vetkussentje, 3-4 mm boven de eierstok. Kritische stap: Zorg dat de incisie gaat alleen door middel van de helft van het vet pad; doorboren helemaal door naar de onderzijde veroorzaakt lekkage. Wees snel en onverwijld na deze stap. Voor cel transplantaties, vul een injectiespuit (30 gauge naald) met 10-20 ul van de cel-basaal membraan matrix-mengsel en te injecteren in het vet pad incisie. Voor eileider transplantatie, pick-up de eileider with fijn pincet en plaats in 10-20 pi basaal membraan matrix op ijs bewaard. Met behulp van een 0,1-10/20 ul XL afgestudeerd filter tip (ingekort 3 mm) halen het weefsel en basaal membraan matrix schorsing en de uitstoot in het vet pad incisie. Wacht 5 minuten voor het basaal membraan matrix te stollen en plaats de voortplantingsorganen terug in het buikvlies. Sluit de spieren met 2 hechtingen van chirurgisch hechtdraad en de huid met twee kleine wond clips of chirurgisch hechtdraad. Herhaal stap 2,4-2,8 naar een PBS-basaal membraan matrix-mengsel te transplanteren naar de contra-laterale vet pad van het dier dat als controle zal dienen. Kritische stap: Na de operatie plaats het dier op een verwarmingselement, omdat warmteverlies is snel in verdoofde muizen. Laat dier terug op een verwarmingselement in de moedertaal kooi en observeer het dier tot helemaal wakker uit de narcose. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn sterna behouden heeft herwonnenl recumbence. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug. Doe wat vooraf nat voer pellets in de kooi naast droogvoer op de kooi na de operatie. Solliciteer post-operatieve pijnstillers als dat nodig is voor de komende dagen en onderzoek dagelijks de wond. Solliciteer antibiotica volgens de goedgekeurde dier protocol als wondinfectie optreedt. Verwijderen wondklemmen 10 dagen na de operatie als de wond volledig gesloten. 3. histologie en Image Acquisition Graft verzamelen en bewaren Bereid 4% paraformaldehyde oplossing door het mengen van 26 ml DDH 2 O met 4 ml 10 x PBS en 10 ml 16% paraformaldehyde oplossing. Ontleden in een blok, de geënt ovariële vet pad, eierstokken, baarmoeder buis, 0,5 cm baarmoeder zoals beschreven in de stappen 1.1.1-1.1.4. Plaats onmiddellijk in 2 ml 4% paraformaldehyde en vaststellen voor 2 uur, bij kamertemperatuur. Van hetzelfde dier, ontleden de niet-geëntecontralaterale ovariële vet pad systeem getransplanteerd met PBS-basaalmembraan matrix mengsel als een controle (zie stap 2.9). Fix en werkwijze op dezelfde manier. Na fixatie wassen weefsels driemaal met PBS gedurende 5 minuten en incubeer overnacht in PBS bij 4 ° C. Voor het hele-mount beeldvorming van de ovariële vet pad ga dan naar stap 3.2.1. Let op: Nadat het beeld overname weefsels kunnen worden ingevroren (3.3.1) of verwerkt voor het inbedden in paraffine (3.3.2). Overnacht incubatie in 30% sucrose in PBS bij 4 ° C verbetert de kwaliteit van bevroren weefsels. Afbeeldingen verwerving Place whole-mount ovariële vet pad systemen in PBS gevulde gerechten en beeld met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met epi-fluorescentie gehechtheid en high-definition kleuren camera, met 4, 10x doelstellingen, en een stereomicroscoop voorzien van een fluorescentie gehechtheid, kleurencamera en Plan Apo 1xWD70, ED Plan 1.5xWD45 doelstellingen. histologie volgendwhole-mount beeldacquisitie (3.2.1) plaats een 200-500 pi druppel inbedding medium voor bevroren weefselmonsters op een 2 x 1 cm stuk van het laboratorium film en met behulp van een tang, overdracht van het weefsel aan de daling. Pak de film aan een rand en de overdracht van het weefsel-medium dalen tot een 1,8 ml cryogene flacon. Sluit het flesje en duik in vloeibare stikstof. Bewaar bevroren weefsels bij -80 ° C. Als alternatief, ga dan met de standaard paraffine inbedding. Gebruik 20-40 volumina weefsel volume voor elke stap. Dompelen weefsel eenmaal in 65% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. Dompelen weefsel eenmaal in 70% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. In deze fase monsters kunnen worden bewaard maanden bij kamertemperatuur. Dompelen weefsel eenmaal in 90% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. Dompelen weefsel eenmaal in 95% ethanol gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. Dompel weefsels tweemaal in absolute ethanol (200 proof) gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. <li> Dompel weefsels tweemaal in chloroform gedurende 30 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. Dompelen eenmaal weefsels in paraffine voor 30 min, zacht schudden bij 58 ° C. Dompel weefsels eenmaal in paraffine gedurende 12 uur, schudden zachtjes op 58 ° C. Dompelen weefsels in paraffine eens 3 uur bij 58 ° C. Plaats weefsels in metalen mallen histologie en vul vormen met 58 ° C paraffine. Voeg een plastic histologie cassette bovenop de paraffine en paraffine afkoelen tot 4 ° C. Extract paraffine-tissue block en bewaar bij kamertemperatuur. Opmerking: Paraffine temperatuur mag niet hoger zijn dan 58 ° C voor een optimale conservering van weefsel geschikt zijn voor immunohistochemische kleuring. Als alternatief, Bereid je voor op het inbedden in paraffine met Specimen Processing Gel. Zuig het PBS en de overdracht whole-mount weefsels tot 70% ethanol. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. In een waterbad, voorverwarmen specimen verwerking gel tot 60 ° C. Pipette 200 ul van het monster verwerking gel op een laboratorium film-beklede petrischaal. Met behulp van fijne dissectie tang overdracht van de hele-mount weefsel systeem om het monster verwerking gel druppel. Laat het monster verwerking gel plug stollen bij kamertemperatuur stollen of de stekker voor 10 min bij 4 ° C. Plaats het monster verwerking gel ingebed weefsel in histologie weefselcassettes ingeklemd tussen biopsie foamtape. Insluiten in paraffine zoals in stappen 3.3.2-3.3.2.10. Opmerking: Specimen verwerken gel inbedding voorkomt en maakt het mogelijk het behoud van kleine breekbare weefselmonsters. Opmerking: Tissues bevroren of paraffine inbedding geschikt zijn voor immunohistochemische kleuring 14,15.