移植到小鼠卵巢脂肪垫

所描述的所有体内的工作是由美国康奈尔大学机构动物护理和使用委员会的批准。 1.样品制备卵巢脂肪垫化验分离和小学文化输卵管上皮（TE）细胞用CO安乐死施主6-8周龄处女β肌动蛋白增强绿色荧光蛋白（EFGP）或β肌动蛋白香菇红色荧光蛋白（DsRed的）小鼠2施用颈椎脱位。用脚趾捏验证成功安乐死。 放置在吸收性悬垂性，腹侧的个体小鼠，然后擦拭用70％乙醇的腹部。通过在主体中线作出侧向切口并用指尖拉扯皮肤上方并朝向鼠标的头部和尾部切口下方打开皮肤。 使用钝钳抓住腹膜，并用细剪刀剪开体腔削减。轻轻推肠癌的线圈Ë一边，找到生殖器官。 用细镊子接起来一听子宫角切0.5厘米其中子宫角分开点以上。按住子宫角，解剖走附着于子宫角结缔组织，输卵管，卵巢和卵巢脂肪垫。放置解剖生殖道中以6毫升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中一个盘。与第二生殖道继续。 转移菜生物安全柜，洗组织3次6毫升无菌PBS。继续位于生物安全柜解剖显微镜下工作。抓住用细镊子子宫角，并通过在子宫 – 输卵管连接切断断开输卵管子宫角。剪出通过将25g针头周围的卵巢卵巢囊。 注意：卵巢囊已被删除后，解剖完成且个体子宫管保持在PBS溶液。 转接SINGL在PBS的50微升下降到3.5 cm的天线Ë输卵管和剁碎成用28号针头0.1毫米件。转移到200微升的消化缓冲液1（Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）F12（补充有300单位毫升-1胶原酶和100单位毫升-1透明质酸酶火腿的）培养基），并在5％CO孵育1小时，在37℃ 2孵化器。 保温后，加入1ml 0.25％胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）和暂停与1毫升枪头（又名蓝色尖）20次3分钟的帮助下的解决方案。添加5毫升+ 4℃的DMEM / F12含有2％胎牛血清（咸的）培养基。 通过离心（600 RCF，5分钟，室温（RT）），收集组织和加入1毫升消化缓冲液2（DMEM F12（补充有7毫克毫升-1分散酶II和10微克毫升-1脱氧核糖核酸酶I含的）培养基（ DNA酶I））。暂停组织粒料20次用1毫升吸管缇帮助页。 加入5毫升血清自由完整的鼠标输卵管上皮生长培养基（M-TE-GM，表1）。 收集通过离心细胞（600 RCF，5分钟，RT）。加入1 ml M-TE-GM，暂停和血球计数细胞。种子1×10 5细胞以每孔1毫升24孔低安装板并孵育以M-TE-GM，在37℃在一个5％CO 2培养箱中培养4天。 每天改变介质。 从β肌动蛋白-EGFP或β肌动蛋白DsRed的小鼠制备原代培养悬浮液的TE细胞的单细胞悬浮液。 从24孔低附着板收集TE悬浮培养。离心（600 RCF，5分钟，RT），并暂停细胞沉淀用1毫升0.25％的胰蛋白酶-EDTA。在一个5％CO 2培养箱孵育10分钟，在37℃。 通过加入5ml的DMEM / F12含有5％胎牛血清（火腿的）培养基停止胰蛋白酶活性。通过离心（600 RCF，5分钟，RT），收集细胞沉淀。 洗涤细胞沉淀两次用4ml冷的PBS（4℃），加1ml的PBS每细胞沉淀，并暂停。计数细胞血球和转移到1.7毫升离心管。在冰上工作，1×10 5个细胞添加到10微升的PBS，然后加10微升基底膜基质。中止，并在冰上输送到动物房。 注：在无菌条件下进行的生物安全柜的所有解剖和组织培养工作。 永生化人细胞的制备分别生长慢病毒EGFP和-mCherry标记的人永生化卵巢表面上皮细胞lineHIO118直到80 -在5％CO 2培养箱10 cm的培养皿90％汇合，在37℃。 用10ml PBS洗涤碗碟两次，加入1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA每个培养皿，并在5％CO 2培养箱中于37℃孵育10分钟。通过加入10ml的DMEM / F12含有5％胎牛血清（火腿的）培养基终止反应。搜集通过离心细胞沉淀（600 RCF，5分钟，RT）。 洗涤细胞沉淀两次用10ml冷PBS（4℃），加1ml的PBS每细胞沉淀，并暂停。计数细胞血球和转移到1.7毫升离心管。 冰工作，加入1.0×10 6伦蒂- mCherry标记的细胞+ 1.0×10 6伦蒂-EGFP标记的细胞至10微升PBS。添加10微升基底膜基质。中止，并在冰上输送到动物房。 对输卵管的制备解剖如步骤1.1.1-1.1.5个别输卵管从6-至在PBS 8周龄处女β肌动蛋白DsRed的小鼠。转移单输卵管进入PBS的解剖显微镜下200微升下降。通过除去输卵管系膜，它支持子宫管的部分的宽韧带的一部分轻轻解开用镊子和28号针的帮助下输卵管。将单一的开卷输卵管中的2下降00微升冰冷的PBS直到收件人的卵巢脂肪垫被暴露并准备接收的移植。 2.卵巢脂肪垫移植注意：每次消毒手术动物之间的仪器。准备和安排所有设备提前。背移植到右侧卵巢脂肪垫是优惠的，因为这避免了脾脏。但是，收件人可能有两个卵巢脂肪垫移植。 使用同基因小鼠或重症联合免疫缺陷（SCID / NCR）小鼠原代细胞的接受者。对于人细胞，如HIO118细胞，使用NOD / SCID /伽马（NSG）小鼠或SCID小鼠。 麻醉受体小鼠与2,2,2-三溴乙醇的单个腹膜内注射以0.15毫升/ 10g体重的剂量。将动物在加热垫，在动物引擎盖，然后按确认踏板反射（趾捏）的损失适当麻醉。对眼睛应用兽医药膏，以防止干燥而动物处于麻醉状态。注入与镇痛酮洛芬动物皮下注射4毫克/克体重的剂量来治疗为手术后疼痛。 注意：作为一个替代方案，使用异氟烷麻醉。放置在感应室中的动物，并调整氧气流量计0.8-1.5升/分和异氟烷蒸发器，以2-3％。从腔室中取出麻醉动物，让它从掩模呼吸异氟烷和氧气流量计设定为0.4-0.8升/分钟和异氟烷蒸发器，以1.5％，然后启动手术。 剃须用40号快船手术区;从一个区域除去毛发2倍手术区，准备用碘伏三种防腐剂磨砂，接着用70％乙醇的剃光皮肤上，并用无菌披盖覆盖。 移动至动物位于生物安全柜中的解剖显微镜下。在直接卵巢脂肪垫上面的背内侧位置的切口暴露生殖道。 注：暴击iCal的一步：准确的皮肤切口有利于伤口愈合，用手术刀在步骤2.4建议。 使用钝细镊子拔卵巢脂肪垫通过仔细朝中线切口，尽量减少对神经和大血管的损伤。 关键的一步：如果发生出血，停止手术，并考虑移植到不同的宿主动物。 以下的28号斜口针的帮助下解剖显微镜的控制使2-4毫米深的切口进入卵巢脂肪垫，3-4毫米卵巢以上。 关键的步骤：确保切口只有经过脂肪垫的一半;通过向底侧穿刺一路导致泄漏。迅速而没有进行这一步后延迟。 对于细胞移植，填充注射器（30号针头），用10-20微升细胞基底膜基质混合物和注入脂肪垫切口。对于输卵管移植，拿起输卵管机智^ h细镊子和10的地方 – 20微升基底膜基质保持在冰上。使用0.1〜10/20微升XL毕业的过滤嘴（3毫米缩短）拿起组织和基底膜基质悬挂和释放入脂肪垫切口。 等待5分钟，基底膜基质固化并放置生殖道回腹膜。手术缝合2拆线并用两个小伤口剪辑或手术缝合皮肤紧密的肌肉。 重复步骤2.4-2.8到PBS-基底膜基质混合物移植到动物将作为对照的对侧脂肪垫。 关键步骤：手术后放置在一个加热垫的动物，因为热损失是在麻醉小鼠迅速。 让动物在天然笼上的加热垫恢复并观察动物直到从麻醉完全清醒。不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨升靠着。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。 将预湿的食物颗粒极少数在笼子里面除了干上手术后的笼子食品。如果需要在未来几天申请手术后止痛药和日常检查伤口。根据批准的动物协议，如果发生伤口感染应用抗生素。手术后伤口取出夹子10天的时间伤口已经完全关闭。 3.组织学和图像采集嫁接收集和保存通过混合26毫升DDH 2 O的用4ml PBS 10倍和10毫升16％多聚甲醛溶液制备4％多聚甲醛溶液。 解剖一个块，所栽种的卵巢脂肪垫，卵巢，输卵管，如步骤1.1.1-1.1.40.5厘米子宫。立即将2毫升4％多聚甲醛和修复2小时，在室温。从相同的动物，解剖非嫁接用PBS基底膜基质混合物作为控制对侧移植卵巢脂肪垫系统（见步骤2.9）。固定并以同样的方式处理。 固定后洗净组织中，用PBS 3次5分钟，并在4℃在PBS中孵育过夜。 对于卵巢脂肪垫的整个安装成像继续执行步骤3.2.1。 注：图像采集组织可冻结后（3.3.1）或加工的石蜡包埋（3.3.2）。在PBS中30％蔗糖过夜孵育在4℃提高冷冻组织的质量。 图像采集地点整个安装在PBS充满菜肴和使用倒置显微镜图像配有落射荧光附件和高清晰度彩色摄像机，卵巢脂肪垫系统，有4个，10倍的目标，并配有荧光附件，彩色摄像机和规划立体显微镜阿波1xWD70，ED计划1.5xWD45目标。 组织学以下全安装图像采集（3.2.1）的地方在2×1厘米长的实验室薄膜和使用镊子冰冻组织标本包埋剂的200-500微升下降，组织转移到下降。拿起膜在一个边缘和传送组织培养基降低到了1.8毫升低温小瓶中。关闭小瓶陷入液氮。在-80℃保存冷冻组织。 另外，继续与标准石蜡包埋。使用20-40体积组织体积的每个步骤。 浸入组织在65％的乙醇一次30分钟，在RT轻轻晃动。 浸入组织在70％乙醇一次30分钟，在RT轻轻晃动。在此阶段的样品可以储存在RT个月。 浸入组织在90％乙醇一次30分钟，在RT轻轻晃动。 浸入组织在95％乙醇一次30分钟，在RT轻轻晃动。 30分钟浸泡组织在无水乙醇（200标准强度）的两倍，在RT轻轻晃动。 <LI>沉浸组织两次氯仿30分钟，在室温下轻轻晃动。 在石蜡浸入组织一次30分钟，在58℃，轻轻摇动。 在石蜡浸入组织一次12小时，在58℃，轻轻摇动。 在石蜡浸入组织一次3小时，在58℃。 将金属模具的组织学和组织填充58℃的石蜡模具。添加的石蜡顶部的塑料盒的组织学和石蜡冷却到+4℃。在提取RT石蜡组织块和存储。 注：石蜡温度不应该适用于免疫组化染色组织的最佳保存超过58℃。 此外，准备的石蜡包埋标本用凝胶处理。 吸出PBS并整体安装的组织转移到70％的乙醇。在室温下孵育2小时。在水浴中，预热检体处理凝胶至60℃。 PipettË200微升样本处理凝胶到实验室薄膜内衬培养皿。用细解剖钳整个贴装组织系统传送到检体处理凝胶滴。 允许样本处理凝胶塞在室温下固化，或在4℃下固化10分钟的插头。 放置在夹在活检泡沫垫之间组织学组织盒的检体处理凝胶包埋的组织。在石蜡中嵌入如步骤3.3.2-3.3.2.10。 注：样品处理凝胶嵌入防止损失，并允许小脆弱的组织样本保存。 注：冻结或石蜡包埋组织保存适合免疫组化染色14,15。