عن طريق الاستجابة أثار اللمس والحركة فحوصات لتقييم أداء العضلات وظيفة في الزرد
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
تنمية العضلات الزرد يتم حفظها للغاية مع أنظمة الثدييات مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة وظيفة العضلات والمرض. العديد من الاعتلالات العضلية التي تؤثر على وظيفة العضلات والهيكل العظمي يمكن تقييم بسرعة وسهولة في الزرد خلال الأيام القليلة الأولى من التطور الجنيني. قبل 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، wildtype الزرد العقد بصورة تلقائية العضلات الذيل وبنسبة 48 HPF، الزرد معرض تسيطر السلوكيات السباحة. انخفاض في وتيرة، أو تغييرات أخرى في، هذه الحركات قد تشير إلى وجود ضعف في العضلات والهيكل العظمي. لتحليل سلوك السباحة وتقييم أداء العضلات في التنمية الزرد في وقت مبكر، ونحن على حد سواء الاستفادة من الهروب الاستجابة والحركة المقايسات أثار اللمس.
المقايسات استجابة الهروب أثار اتصال يمكن استخدامها لتقييم أداء العضلات أثناء حركات انفجار قصيرة الناتجة عن تقلص الألياف العضلية سريعة نشل. وردا على حافز خارجي، وهو في هذه الحالة هو الصنبور علىالرأس، wildtype الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (DPF) عادة ما تظهر موجة السباحة قوية، يرافقه المنعطفات الحادة. أسلوبنا الكمي وظيفة العضلات والهيكل العظمي عن طريق قياس أقصى تسارع خلال حركة السباحة انفجار، وتسارع يجري يتناسب طرديا مع القوة الناتجة عن تقلص العضلات.
في المقابل، تستخدم فحوصات الحركة في وقت مبكر خلال نمو اليرقات الزرد لتقييم أداء العضلات خلال فترات متواصلة من النشاط العضلي. باستخدام نظام تتبع لرصد سلوك السباحة، ونحن الحصول على حساب الآلي وتيرة النشاط والمسافة في 6 أيام الزرد القديم، وهذا انعكاس وظيفة الهيكل العظمي والعضلات الخاصة بهم. قياسات الأداء السباحة قيمة لتقييم المظهري من نماذج المرض والفحص الإنتاجية العالية من الطفرات أو العلاجات الكيميائية التي تؤثر على وظيفة العضلات والهيكل العظمي.
Introduction
وعلى مدى العقد الماضي الزرد تستخدم بشكل متزايد لدراسة العضلات بيولوجيا الخلية والمرض. تطوير الخارجية السريعة للجنين الزرد، إلى جانب وضوحه البصرية، بما يسمح للرؤية مباشرة من تشكيل العضلات والنمو والوظيفة. عملية تنمية العضلات والحفظ جدا في الزرد وسمحت هذه النمذجة الناجح لمجموعة من أمراض العضلات بما في ذلك ضمور العضلات واعتلال العضلات الخلقية 1-8. لم تقدم دراسة تفصيلية لنماذج الزرد فقط رؤى جديدة في البيولوجيا المرضية من هذه الظروف ولكن أيضا توفير منصة لاختبار علاجات مناسبة 6،9-13.
تحليل النماذج الزرد من أمراض العضلات يعتمد على فحوصات موثوقة وقابلة للتكرار لقياس أداء العضلات. وقياس الدراسات السابقة بنجاح قدرة توليد قوة العضلات جذع الزرد في الأسماك ما بين 3 و 7 DPF بواسطةتحفيز بالكهرباء تقلص من الأسماك يجمد تعلق على نظام القوة التنبيغ 14. هذا يمكن أن توفر قياسات مفصلة للقوة ولكنها ليست مناسبة بشكل مثالي لتجارب إنتاجية أعلى، وهناك مزايا لقياس أداء العضلات أثناء السباحة. في 2 DPF العضلات الزرد تعمل بكامل طاقتها ويمكن أن الأسماك تثير حركات السباحة انفجار في الاستجابة للمؤثرات. يتم استخدام الهروب فحص استجابة لمسة واستحضار لقياس التسارع أثناء الحركة السباحة انفجار، والتي يمكن استخدامها كمقياس لقوة مقلص.
أحد التدابير الأكثر استخداما من وظيفة العضلات في المرضى الذين يعانون اعتلال عضلي هو الاختبار مسافة 6 دقائق، الذي يسجل المسافة الإجمالية مشى على سطح مستو من الصعب 15،16. لقد طبقنا اختبار مشابه لقياس وظيفة العضلات في 6 يرقات DPF الزرد، حيث أننا رصد المسافة الإجمالية سبحوا، وعدد من الحركات التي أدلى بها كل يرقة على مدى فترة 10 دقيقة. يتم تنفيذ هذاباستخدام نظام التتبع الآلي، والتي توفر قياسات موثوقة وعالية الإنتاجية من أداء العضلات. الاختبارين العضلات هي تكرار للغاية واستخدمت لتحديد الاختلافات في أداء العضلات في نماذج عضلي الزرد 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ساهمت العديد من النماذج الحيوانية المختلفة بما في ذلك الفئران والكلاب والزرد، الذباب والديدان نحو فهمنا الأساس الجيني والجزيئي للأمراض العضلات، والمساعدة في تطوير المناهج العلاجية لمكافحتها. الزرد يضم العديد من المزايا لدراسة مرض في العضلات. يوفر الزرد نظام manipulable وراثيا لتقييم الزخرفة العضلات المعقدة في بيئة الفسيولوجية المناسبة، وهو أمر غير ممكن في نظم الاستزراع في المختبر. على عكس النماذج الحيوانية الفقاريات الأخرى، وعدد كبير من الأسماك المنتجة، جنبا إلى جنب مع وضوحه البصرية، يسهل السريع، وارتفاع الإنتاجية في الصناعات الكيميائية الجسم الحي والفحص الجيني.
نحن هنا وصف وضع المقايسات حركة الزرد لتوفير الإنتاجية العالية وطريقة تلقائية لتقييم أداء العضلات خلال مرحلة التطور الجنيني الزرد. على حد سواء المقايسات لا بد من الاعتراف بأن الإيقاعات اليومية ووالمثيرات البيئية الخارجية تؤثر تأثيرا كبيرا على سلوك السباحة الزرد 17،18. والاختبار المتكرر لنفس الزرد يؤدي أيضا إلى التعود مما تسبب في انخفاض ردا على اللمس التحفيز 23. ولذلك، من أجل تحقيق نتائج استنساخه بين التجارب كل جنين الزرد ينبغي اختبار مرة واحدة فقط، وهي المرة من الظروف اليوم والإضاءة ينبغي أن تكون موحدة، ويحتاج إلى درجة حرارة الماء إلى تنظيم محكم.
عن طريق لمسة أثار تحليل في 2 DPF يمكننا قياس مباشرة أقصى تسريع عمل السباحة انفجار، الذي يتناسب مع قوة العضلات. وقد درست تقنيات السابقة في الزرد قوة العضلات عن طريق ربط طرفي الأجنة إلى التجريبية يلي المعدات التي تقلص العضلات وحفز باستخدام المجال الكهربائي والقدرة على توليد قوة العضلات 14 يقاس. بينما هذه الطريقة يقيس قوة توليد قدرة رانه العضلات اليرقات، فإنه لا قياس القوة الفعلية الناتجة عن العضلات اليرقات أثناء السباحة. لذا قمنا بتطوير طريقة لتقييم بشكل غير مباشر على القوة المتولدة أثناء الحركة السباحة اليرقات الطبيعية لتوفير مقياس عام لصحة العضلات. نظام الفيديو عالية السرعة، قادرة على تسجيل حركات الزرد الفردية في معدل الإطار من 1000 لقطة / ثانية يمكن استخدامها لتحديد الاختلافات صغيرة ولكنها مهمة في وظيفة العضلات، والتي لا يمكن تمييزها مباشرة بالعين. وسوف تكون ذات فائدة لنرى كيف سابقا عن تغييرات في توليد قوة حفز كهربائيا ربط مع التغييرات في الأداء السباحة.
وبالإضافة إلى ذلك أثار لمسة يمكن أيضا فحوصات استجابة استخدامها لتقييم الكينماتيكا السباحة، مثل الشكل وسرعة موجة الجسم أثناء الحركة السباحة 24، لإعطاء القياس الكمي للسلوك تحركي.
ويرجع ذلك إلى حركة عفوية من zebrafاليرقات العش بعد 3 DPF، لم نكن قادرين على إجراء فحوصات لمسة واستحضار لقياس وظيفة العضلات. على العكس من ذلك، قمنا بقياس أداء العضلات على مدى فترة أطول من خلال تحديد سبحوا المسافة من اليرقات الزرد في 6 DPF. هذا الاختبار، على الرغم من أن مقياس غير مباشر من وظيفة العضلات، ويمكن استخدامها لتحديد الأسماك التي تظهر ضعف أداء العضلات 8 أو التنكس العصبي 25،26. هذا الاختبار ليس فقط يوفر قياس مشابه لاختبار مسافة 6 دقائق ولكن هو أيضا مناسبة لالآلي عالية الإنتاجية في شاشات المخدرات أو الطفرات الجسم الحي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
