哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

1.細菌培養興味21の具体的な分泌因子の研究のために使用される同質遺伝子変異株を生成します。 注：含まれ、これらの実験のために利用GASM1T1 5448株 WT GAS」、（Δ 佐賀などのテキストに略す） 佐賀 Δ 猫 SLS欠損変異体、 佐賀補完株（Δ 佐賀+佐賀などのテキストに略記する）21。 関心の細菌株の一晩液体培養物を準備します。ヒト細胞に感染する前に16-20時間、37℃でガスM1T1にトッドヒューイットブロス-10ミリリットルで5448株を成長させます。 遠心分離で一晩細菌培養物（10分間2400 RCF）と新鮮な細菌培地中に再懸濁。 注：同じボリュームで再懸濁し、一晩培養物を（5〜10 ml）に増殖させたとして、一般的に望ましい初期光学密度を生産します。 への細菌培養物を正規化600 nmの（OD 600）での同一の光学密度は、試験される全ての株に対して得られるまで、追加の細菌培地中で再懸濁した培養液を希釈することにより、同等の開始濃度（約1.0のOD 600は便宜のために推奨されます）。 注：これらの研究では、静止期の細菌培養物を直ちに正規以下の宿主細胞に感染するために使用しました。しかし、細菌出口静止期のいくつかの株としてnonsynchronouslyは、これは、目的の株の場合であることが見出された場合、対数期培養物を用いて宿主の感染を開始することがより適切であり得ます。 さらなる分析の前に、感染多重度（MOI）、または宿主細胞当たりの細菌の割合を決定することができるように、出発培養物中ミリリットル本当たりのコロニー形成単位（CFU）を決定するためのアッセイをカウントコロニーを行います。 1ミリリットルに所望の光学高密度化に正規化された細菌培養物の連続希釈液を準備TYリン酸緩衝生理食塩水（PBS）または適切な細菌増殖培地（トッド – ヒューイットブロスをこれらの研究において使用しました）。可算コロニー（30から300コロニー）と寒天プレートの少なくとも1セットを生成するために10 -1〜10 -6までの範囲の希釈液を調製します。三連ですべての希釈を実行します。 分析されている細菌種のための適切な培地を含む寒天プレート上に各シリアル希釈液100μlを移します。 注：トッド・ヒューイット寒天培地は、これらの研究に使用しました。 均等に寒天プレートの表面全体に100μlのアリコートを配布し、液体は寒天の中に吸収されるまで広がり続けるにはガラスやプラスチック細菌スプレッダーを使用してください。滅菌技術を使用して炎の下で実行します。 一晩または可算コロニーが現れるまで37℃で寒天プレートをインキュベートします。 各プレート上で増殖するコロニーをカウントし、次のformuによって元の培養におけるCFU / mlに計算しますラ：コロニー数ミリリットル中にプレート連続希釈/培養液量のX逆。 例えば （200コロニーのx 1/10 -5希釈）/ = 2.0×10 8 CFU / mlのメッキ0.1ミリリットル 2.宿主細胞培養物目的の分析のための適切な宿主細胞株を取得します。 注：HaCaT細胞ヒト上皮ケラチノサイト29、V. Nizetからの親切な贈り物は、これらの研究のために使用しました。 10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で100mMの培養皿でHaCaT細胞を維持します。 5％CO 2で37℃でインキュベートします。 透過膜を挿入し、システム3.宿主細胞感染彼らは90％の密集度に到達するまで、適切な組織培養皿でプレート細胞とは、彼らが成長することができます。 注：これらの研究で使用したHaCaT細胞は、典型的には、2-3 D内の密集度に達しますメッキ後のAYS。 溶解物収集のために（ 例えば 、分析およびアデノシン三リン酸（ATP）決意アッセイシグナル伝達）、/ウェル約3×10 5細胞の播種密度で6ウェルディッシュにHaCaT細胞をプレート。 /ウェル約3×10 5細胞の播種密度で6ウェルディッシュ内の滅菌ガラスカバースリップ上の免疫蛍光イメージング実験、プレート細胞について。 エチジウムホモダイマー膜透過および乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイのために、/だけでなく、約5×10 4細胞の播種密度で24ウェル皿にHaCaT細胞をプレート。 治療の直前に、1×滅菌PBSで細胞を洗浄。 細胞に新鮮な増殖培地を適用します。ここに記載された条件について、6ウェルプレートまたは24ウェルプレートウェル当たり0.5ミリリットル媒体用ウェル当たり2ミリリットル培地を適用します。薬理学的治療が試験されている場合は、新鮮な培地と混合し、このSTEの間に適用されますP。 注：一部のアッセイは、代替メディアが必要な場合があります。例えば、フェノールレッド、高血清濃度は、LDH放出アッセイを妨害し、1％ウシ血清アルブミン（BSA）（V / W）、2mMのL-グルタミン、および1mMピルビン酸ナトリウムを補充したフェノールレッドを含まないDMEMでしたこれらの実験のために利用。 新鮮な培地を適用した後、慎重に各ウェル中の滅菌0.4μmの透過膜インサートを配置します。層流フードで、このステップを実行し、各ウェルに透過膜インサートを転送するために滅菌ピンセットを使用しています。 製造業者の説明書に従って、各ウェルの上部チャンバーに新鮮な細胞培養培地を適用します。ここに記載された条件について、6ウェルプレートまたは24ウェルプレートウェル当たり0.1ミリリットル媒体用ウェルあたり1ミリリットル培地を適用します。 透過膜インサートシステムの上部チャンバーに（セクション1を参照）は、正規化された細菌培養物の適切な量を適用します。感染していないCONTRのための細菌培地を使用しますオールトリートメント。ここで説明する結果を得るために、24ウェルプレート用室あたりの正規化された文化の25μlのを追加し、6ウェルプレート用室あたりの培養液100μlを追加します。 注：これらの研究では、野生型または変異GASは宿主細胞に適用されました 10 MOIのMOIは、最終的な真核生物の細胞数に基づいて算出された時に（ 例えば、2×10 6細胞/ウェル）を10倍の細菌が感染期間の開始（ 例えば、2 xで宿主細胞毎に添加されたように、ウェル当たり10 7 CFU）。適切なMOIは、異なる細菌種とし、所望のフォローアップ分析によって変化するであろう。 注：非感染コントロールの細菌の培地を使用することに加えて、本技術の特定の用途のための他の有用なコントロールは、熱死滅細菌を含んでいてもよいか、比較のための細菌の培地を過ごしました。 5％CO 2、37℃で感染した細胞をインキュベートします。 4.サンプルコレクション <オール> フォローアップのために無傷の細胞で、細胞培養培地、宿主細胞溶解物、またはガラスカバースリップを分析収集するために、注意深く滅菌ピンセットで透過膜インサートを除去することによって開始します。 分泌ホストProtiensの評価の場合： 1.5ミリリットルチューブに下室からの培地を収集します。収集中の単層を乱さないようにしてください。 細胞破片を除去するために4℃で10分間14,000 RCFで遠心分離サンプル。 -20℃で新鮮な1.5mlチューブとストアに50μlの上清が、すべてを削除するか、すぐに使用しています。 宿主細胞Lystatesの評価のために： 静かに宿主細胞の単層を上記培地を吸引除去します。これはサンプルの損失につながる可能性があるため、単層を乱さないようにしてください。 1×PBSで細胞を1回すすいでください。 静かにPBSを吸引。すぐに所望のタンパク質濃度を達成するために、氷冷溶解緩衝液の適切な量を適用し、インキュベート15分間氷上でのサンプル。 0.5および1.5 mg / mlとの間のタンパク質濃度を達成するために、200μlの各6ウェルプレートのウェル当たりの溶解緩衝液350μlの間に適用されます。 これらの研究で使用される溶解緩衝液は、脱イオン水で構成された、1％（v / v）のノニデットP40の代替、ホスファターゼ阻害剤カクテル、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル：注意。具体的な試薬は、材料および装置のセクションに記載されています。 各ウェルのプレート表面から細胞を分離するために、セルスクレーパーを使用して、よく1.5mlチューブにそれぞれの内容全体をピペット。 遠心分離機のサンプルを4℃で20分間14,000 RCFで。 可溶性溶解物の成分を評価するために、-20℃で新鮮なチューブやストアに上清を除去したり、すぐに使用します。 核または他の不溶性の溶解物の成分を評価するために、-20℃でペレットと店を予約したり、すぐに使用しています。 免疫蛍光イメージングによる評価の場合： として海賊媒体と1×冷PBSで細胞を洗浄します。 PBS中で一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液で細胞を固定（W / V）。 注：これらの研究では、PFAの1ミリリットルを各6ウェルプレートのウェルに添加しました。 5.推奨用途 SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによってシグナル伝達解析をホスト 4.3節で説明したように、宿主細胞溶解物を収集します。 ビシンコニン酸（BCA）アッセイまたはタンパク質標準30を使用して同等のことで、各サンプル溶解物のタンパク質濃度を決定します。 ロードする前と4〜15％ポリアクリルアミドゲルまたは適切な代替31上でサンプルを実行しているサンプル間のタンパク質濃度を正常化します。 新しい1.5mlチューブに、各サンプル（ 例えば、20μgの）からの同じタンパク質の量をピペッティングし、溶解緩衝液の可変ボリュームを追加することによって、試料濃度を正規化する（バッファ量=総体積-試料体積試料を横切る総容量（ 例えば、50μl）を、最終タンパク質濃度と同等にするために各チューブに）加えました。 ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（または同等のもの）への転送サンプル。ここで説明する結果を得るために、さらに45分間、70ボルトに電圧を上げる前に、2時間25ボルトでサンプルを転送します。 200mMのトリス塩基、1.5Mのグリシン及び脱イオン水中の20％メタノール（v / v）からなる移動バッファを使用。 トリス中の5％BSA + 0.1％のTween 20でブロック膜は、生理食塩水（TBS）をバッファリング。使用する抗体については、製造元の推奨事項に基づいて、それに応じて調整します。 4℃で一晩一次抗体を有する膜をインキュベートします。メーカー推奨希釈で使用してください。 TBS + 0.1％ツイーン20で1.5時間、膜を洗浄します。すべての10-15分をバッファリフレッシュ。 部屋のtemperatで1.5時間、5000：西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とインキュベート1の希釈で二次抗体を抱合URE。 TBS + 0.1％ツイーン20で1.5時間、膜を洗浄します。 15分 – すべての10をバッファリフレッシュ。 製造業者の指示に従って前フィルムに現像に化学発光検出試薬で膜をインキュベートします。所望に応じて他の検出方法を用いることができます。 宿主細胞免疫蛍光染色およびイメージングセクション4.4に記載されるように、宿主細胞を含むカバースリップを修正しました。 PFA溶液を除去し、PBSで処理した細胞を含むカバースリップを2回洗浄し、洗浄の間に吸引します。 注：PFAは非常に毒性があり、適切に処分しなければなりません。 1％PBSで、室温で2時間カバーガラスブロック（w / v）の正常ヤギ血清、2％（v / v）のトリトンX-100、および0.5％（v / v）のツイーン20。 バッファごとに10分を更新、30分間PBSでカバースリップを洗ってください。 ゾルをブロックで1：50の比率（またはメーカーが推奨するなど）で一次抗体とカバースリップをインキュベートution 4℃で一晩。 30分毎にバッファリフレッシュ、PBSで1.5時間、カバースリップを洗ってください。 ブロッキング溶液への抗体の200：1の比を用いて、（ヤギ抗ウサギIgG AlexaFluor488、これらの研究に使用した）二次抗体で、室温で2時間、カバースリップをインキュベートします。 洗浄は、バッファごとに20分を更新、1時間カバースリップ。 希望の汚れを適用します。 注：ブロッキング溶液中で千：1の比率でDAPI（核染色）およびローダミン – ファロイジン（アクチン染色）を利用し、これらの研究を。 室温で30分間の核とアクチン汚れでカバースリップをインキュベートします。 10分毎にバッファリフレッシュ、室温で30分間PBS中でカバースリップを洗ってください。 マウンティング培地を用いてガラススライド上にカバースリップをマウントします。 カバースリップは、シールやイメージングに先立って一晩スライドに設定することができます。ここに記載の結果を得るために、蛍光顕微鏡USIに画像を収集します標準の20X目的​​をngの。撮影した画像を処理するためにImageJの顕微鏡イメージングソフトウェアを使用してください。 エチジウムホモ二量体細胞死アッセイ各ウェル滅菌PBSで細胞を2回洗浄から培地を吸引。 PBSで4μMのエチジウムホモダイマー-1を適用します。 暗所で30分間室温で細胞をインキュベートします。 528 nmの励起および590nmでのカットオフ値を持つ617 nmの発光に設定し、プレートリーダーを用いて蛍光のレベルを決定します。 サポニン（w / v）の各ウェルに以下の初期読み取りに0.1％を加え、プレートを同じ設定でプレートをもう一度読む前に（揺らしながら）室温でさらに20分間インキュベートすることができます。 （ポストサポニン）を読み取る第二の蛍光によって初期蛍光読み（後処理）を分割し、各ウェルについて個別パーセント膜透過を決定します。 ATP決意アッセイ<li>上記のセクション4.3で説明したように溶解物を収集します。 BCAアッセイまたは類似の30を介して溶解物中のタンパク質レベルを正常化します。 発光ベースのATP決意キットや、メーカーの指示に従って同等のものを使用して、細胞ATPレベルを決定します。 正規化は、対応する非感染対照試料に値を処理しました。 LDH放出アッセイ 4.3節で説明したように感染後、上清を収集します。 製造業者の説明書に従ってLDH放出のための細胞傷害性検出キットを使用して、LDH放出を評価します。