Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen
Summary
Hier wird ein Verfahren zur Herstellung einer permeablen Membran insert-basierten Infektionssystem die Auswirkungen von Streptolysin S zu untersuchen Verwendung eines sezernierten Toxin produziert von Gruppe A Streptococcus, auf Keratinozyten beschrieben. Dieses System kann leicht auf die Untersuchung von anderen sezernierten bakteriellen Proteinen auf verschiedenen Wirtszelltypen während der Infektion angewendet werden.
Abstract
Viele bakterielle Pathogene sekretieren potent Toxine in der Zerstörung von Wirtsgewebe zu unterstützen, zu initiieren Signalisierungsänderungen in Wirtszellen oder Reaktionen des Immunsystems im Verlauf der Infektion zu manipulieren. Obwohl Verfahren entwickelt worden , um erfolgreich zu reinigen und sehr viele wichtige Virulenzfaktoren produzieren, gibt es noch viele bakterielle Toxine , deren einzigartige Struktur oder umfangreiche post-translationale Modifikationen machen sie schwer in in vitro – Systemen zu reinigen und zu studieren. Außerdem, selbst wenn reines Toxin erhalten werden kann, gibt es viele Herausforderungen im Zusammenhang mit den spezifischen Wirkungen eines Toxins unter den relevanten physiologischen Bedingungen zu studieren. Die meisten in vitro Zellkulturmodelle entwickelt , um die Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxinen auf Wirtszellen zu bewerten beinhalten Inkubieren von Wirtszellen mit einer einmaligen Dosis von Toxin. Solche Verfahren nähern schlecht, was Wirtszellen während einer Infektion tatsächlich Erfahrung, wo Toxin durch kontinuierlich produziert wirdBakterienzellen und nach und nach im Verlauf der Infektion ansammeln. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines permeablen Membraneinsatzes Basis bakterielle Infektion System die Auswirkungen von Streptolysin S, ein potenter Toxin von Gruppe A Streptococcus, auf menschlichen Epithelzellen Keratinozyten zu untersuchen. Dieses System mehr ahmt die natürliche physiologische Umgebung während einer Infektion als Verfahren, bei denen reine Toxin oder bakterielle Überstände werden direkt an Wirtszellen angewendet. Wichtig ist, beseitigt dieses Verfahren auch die Vorspannung der Host-Reaktionen, die durch Kontakt zwischen den Bakterien und Wirtszellen zu lenken. Dieses System wurde verwendet, um effektiv die Effekte von Streptolysin S (SLS) auf Host Membranintegrität, zelluläre Lebensfähigkeit und zelluläre Signalantworten zu bewerten. Diese Technik kann leicht auf die Untersuchung von anderen sezernierten Virulenzfaktoren auf einer Vielzahl von Säugetierwirtszelltypen angewendet werden, um die spezifische Funktion eines sekretierten Bakterienfaktor d zu untersuchenährend den Verlauf der Infektion.
Introduction
die Funktion der bakteriellen Virulenzfaktoren in Zusammenhang mit der Wirtszelle Infektion zu verstehen, ist ein wichtiger Schwerpunkt der bakteriellen Pathogenese Forschung. Viele bakterielle Pathogene sekretieren aktiv Toxine und andere lösliche Faktoren bei der Zerstörung von Wirtsgewebe zu unterstützen, zu initiieren Signalisierungsänderungen in Wirtszellen oder auf Reaktionen des Immunsystems im Verlauf der Infektion 1 manipulieren – 10. Obwohl Verfahren entwickelt worden , um erfolgreich zu reinigen und zu produzieren sehr viele wichtige Virulenzfaktoren für Studie haben einige bakterielle Produkte einzigartige Strukturen oder umfangreiche post-translationale Modifikationen , die sie widerspenstige Kandidaten für Reinigungsverfahren und somit nicht isoliert untersucht in vitro – Systemen verwendet werden können , machen . Zum Beispiel Streptokokken der Gruppe A, die bakterielle Erreger verantwortlich für eine Vielzahl von Infektionen von Pharyngitis nekrotisierende Fasziitis und toxisches Schocksyndrom bis hin erzeugt ein sezerniertBakterientoxin bekannt als Streptolysin S (SLS) 11-17. Diese ribosomal hergestellte Peptid wird durch das Streptolysin S assoziierten Gens (SAG) Cluster und das reife Produkt wird geschätzt , codiert in der Größe 2,7 kDa zu sein 14-17. Das Protoxin, von SAGA codiert, wird modifiziert , post-translational durch mehrere Enzyme (SAGB, SAGC und SAGD) den reifen, funktionellen Form 15 zu erzeugen – 17. Die Komplexität dieser post-translationale Modifikationen gekoppelt mit der ungewöhnlichen Aminosäuresequenz des Toxins haben das Toxin nicht kompatibel mit allen Reinigung und Strukturaufklärung Anstrengungen gemacht , die versucht wurden 15,17 bis heute. Diese Herausforderungen haben komplizierte Anstrengungen, um die spezifische Rolle dieses Toxin in Host-Pathogenese zu bestimmen.
In Fällen, in denen die Herstellung von gereinigten Toxinen oder anderen sekretierten Faktoren entweder komplex oder nicht möglich ist, Mechanismenerläutern die Funktion dieser Produkte werden traditionell durch die Herstellung von gefilterten Bakterienüberstände untersucht worden, die dann angewendet werden Zellen 18 zu hosten – 20. Es gibt mehrere Herausforderungen mit dieser Technik verbunden. Erstens, viele dieser sezernierten Faktoren, einschließlich SLS, halten keine maximale oder konsistente Aktivität bei Lagerung und Anwendung Zellen zu einem späteren Zeitpunkt zu hosten. Zusätzlich wird, wenn Überstände in einem einzelnen Zeitpunkt gesammelt werden und dann angelegt an Wirtszellen ist es schwierig, physiologische Relevanz zu bestimmen und direkte Rückschlüsse auf die natürlichen Infektionsprozess zu ziehen, wo sekretierten Faktoren erlaubt im Verlauf der Infektion zu einem zu akkumulieren physiologisch relevanten Konzentration. Diese zweite Herausforderung gilt für die Verwendung von bakteriellen Überständen nicht nur, aber auch die Verwendung von gereinigten Toxinen in Wirtszellstudien 1 – 3,8. Zur Bewältigung dieser Probleme, eine durchlässige Membran insert-basierten Infektionssystem wurde die Wirkung von SLS auf Wirtszellen in einer Weise zu beurteilen, entwickelt, die Aktivität optimal Toxin beibehält und beseitigt auch die variable direkten Kontakt zwischen Bakterien und Wirtszellen. In diesem System werden humane Epithelzellen in einer Monoschicht in der unteren Kammer eines Zweikammer gut, und Bakterien werden in die obere Kammer des gleichen gut eingeführt gewachsen. Eine poröse Membran (0,4 um Poren) trennt die oberen und unteren Kammern, so dass sekretierte Faktoren zwischen den beiden Kammern zu verhindern, aber den Durchtritt von Bakterien ausgetauscht werden. Dieses System wurde für eine effektive Bewertung der Wirtsreaktionen erlaubt, die nachhaltig ausgeschieden bakteriellen Komponenten allein zurückzuführen sind , während alle Antworten zu beseitigen , die durch den direkten Kontakt während Gruppe A Streptokokken – Infektion auftreten kann. Obwohl andere sezerniert bakterielle Faktoren neben SLS auch durch die poröse Membran, die Verwendung eines isogenen Mutante Tafel mit Wildtyp (WT) passieren kann, ein SLS-knockout (ΔsagA) und einem SAGA ergänzt Stamm (ΔsagA + SAGA) ermöglicht eine präzise Bewertung der Host – Antworten , die streng SLS-abhängige 21 sind.
26 wenige Studien mit bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen , diesen Ansatz 6,27,28 genutzt haben – obwohl ähnliche permeable Membraneinsatz Systeme für die Untersuchung von sekretierten Faktoren in virale Infektionen, Krebsbiologie und Immunzellmigration beteiligt 22 eingesetzt worden sind. Auch Studien, die solche Systeme eingesetzt haben Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen, in erster Linie auf die Migration von Entzündungszellen oder Bakterien durch eine epitheliale oder endotheliale Monoschicht konzentriert zu erforschen auf die durchlässige Membran Einsatz überzogen. Die permeable Membran insert-basierten Infektion hier beschriebene System ist eine einfache und effektive Methode, die auf der Trennung von Bakterien und Wirtszellen über eine poröse Membran stützt sich die effe zu beurteilencts des sekretierten Toxin, SLS, auf dem Host-Membranintegrität, zelluläre Lebensfähigkeit, zellulären Signaltransduktion und sezernierten Wirtszellfaktoren. Diese Technik kann auf die Untersuchung von anderen sezernierten Virulenzfaktoren auf einer Vielzahl von Säugetierwirtszelltypen angepasst werden, um die Rolle eines spezifischen Bakterienfaktor im Verlauf einer Infektion zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin wird ein Verfahren unter Verwendung einer permeablen Membran insert-basierten Infektionssystem beschrieben , um die Wirkungen des bakteriellen Toxins Streptolysin S auf menschlichen Epithelzellen Keratinozyten in einem in vitro – System zu untersuchen. Dieses Protokoll kann für die Untersuchung von anderen sezernierten bakterielle Virulenzfaktoren sowie alternative Wirtszelltypen angepasst werden. Das kürzlich entwickelte System bietet mehrere Vorteile gegenüber experimentellen Methoden , die gereinigten Toxinen oder gefiltert Bakterienüberstände 1 nutzen – 3,8,18 – 20. Die permeable Membran insert-basiertes System bietet eine ständig aufrechterhalten Dosis des betreffenden bakteriellen Toxins an Wirtszellen, wie es erzeugt wird, welche die Aktivität maximal Toxins ermöglicht aufrechterhalten werden und erhöht auch die Konsistenz zwischen den Experimenten. Darüber hinaus ahmt mehr dieses System genau physiologischen Bedingungen, indem der sezerniert Faktor im Laufe der Zeit ansammeln, da die Infektion fortschreitet und von elimidie Notwendigkeit Ursprung willkürlich bestimmte Toxin-Konzentrationen zu wählen anwenden Wirtszellen. Darüber hinaus würde dieses System auch Mittel zur Verfügung stellen für die Ermittler, ob eine bakterielle Faktor von Interesse zu bewerten geliefert Zellen in einer kontaktabhängige Weise zu hosten. Kontakt-Abhängigkeit wird durch die Erzeugung von isogenen bakteriellen Mutanten defizient in Anhaftung oder durch die Verwendung von Reagenzien häufig getestet, das Anhaften zu verhindern. Das hier beschriebene System würde eine einfache Alternative zu ergänzen oder diese traditionellen Ansätze ersetzen.
Zusätzlich zu den in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben getestet, andere Anwendungen, für die diese Infektion System leicht umfassen die Entnahme von Proben für die Zytokin-Arrays und ELISA-Assays angepasst werden könnten. In diesen beiden Fällen für LDH-Freisetzungstests, daß ein ähnliches Protokoll zu beschrieben sind, können befolgt werden. Obwohl hier nicht gezeigt, wurde dieses System verwendet, um effektiv Wirtszellproben sammeln a seinnalyzed mittels Durchflusszytometrie. In dieser Anwendung wird die permeable Membran Einsatz nach der Infektionsperiode entfernt, die Zellen gewaschen Zellkulturmedium zu entfernen, und wird Trypsin Sammlung der Zellen für die Analyse zu ermöglichen, aufgetragen. Die physikalische Trennung der Bakterien von Wirtszellen ist besonders nützlich für diese Anwendung, da es die Bildung von großen Aggregaten, bestehend aus anhaftenden Bakterien und Wirtszellen zu verhindern hilft, die sonst mit genauen Zellzählung durch das Durchflusszytometer stören könnten.
Obwohl sehr konsequent Wirtsreaktionen beobachtet wurden , wenn die Ergebnisse der durchlässigen Membran Insert-basierten Infektionsstudien mit traditionellen direkte Infektion Studien zum Vergleich wurden einige bemerkenswerte Unterschiede in der Kinetik dieser Wirtsreaktionen wurden 21 beobachtet. Zum Beispiel können Veränderungen in Host-Signalisierung und membranbasierten Zytotoxizität nehmen 30-50% längere Einsatzbasierte Infektionsmodell in der durchlässigen Membran als cor auftretenreagiert direkte Infektion Modelle. Weil die permeable Membran insert-basiertes System Medium erfordert auch zu den oberen und unteren Kammern eines jeden angewandt werden, entwickelt das System für die hier beschriebenen Untersuchungen erforderlich, um eine 30% ige Erhöhung der Gesamtmittelvolumen pro Vertiefung im Vergleich zu entsprechenden vorher direkten Infektionsmodellen verwendet 21. Dieser Unterschied in der Gesamtmittelvolumen, verbunden mit der erhöhten Abstand zwischen Bakterien und Wirtszellen, wenn direkter Kontakt verboten ist, erhöht sich wahrscheinlich die Zeit, die für die SLS durch das Medium zu diffundieren, um Wirtszellen zu erreichen, und die beobachteten Effekte hervorzurufen. Außerdem entfernt die durchlässige Membran Insert-basierte System Faktoren viele GAS Virulenz, die Zellschäden, die einen Beitrag zu veranstalten; das Fehlen dieser zusätzlichen Faktoren in diesem System ist wahrscheinlich auch der Verzögerung in Wirts Zelltod und Initiierung von Host Signalisierungsereignisse im Vergleich zu direkten Infektion 21 beizutragen. Diese Faktoren sollten in Betracht gezogen werdenwenn Experimente Entwerfen anderer sekretierter bakteriellen Komponenten zu beurteilen.
Zu identifizieren, die am sinnvollsten Bedingungen zum Testen der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Faktoren auf Wirtszellen, Testen einer Reihe von Zeitpunkten für jede Anwendung der permeablen Membraneinsatzes basierten Infektionssystem empfohlen wird. Es ist wichtig , unter zu prüfen , welche Bedingungen die spezifische Virulenzfaktoren von Interesse ist optimal produziert (zB log – Phase, stationäre Phase, in Reaktion auf bestimmte Umweltsignale, etc.) , um ihre Auswirkungen zu erfolgreich zu beobachten. In Experimenten konzentrierte sich auf Veränderungen in Wirtssignalproteine Auswertung war es notwendig , den Zeitpunkten auszuwählen , die ausreichend Zeit erlaubt , für SLS Wirtszellen zu erreichen , und in ausreichenden Mengen produziert werden Signalisierungs 21 wechselt zu induzieren. Zur gleichen Zeit, Bewertung von Änderungen in Wirts Signalisierung benötigt, um vor der SLS-induzierte Membranpermeabilisierung durchgeführt werden, da dieser Effekt complicates die Sammlung von Wirtszelllysaten für die Analyse. Zelltod durch SLS induzierte optimal in direkten und permeable Membraneinsatz basierte Infektionsmodellen mehrere Stunden nach dem Beginn der berichteten Signalereignisse 21 beobachtet werden konnte. Weiterhin Zeitpunkte von Interesse bei der Auswahl ist es auch wichtig, sicherzustellen, dass die Bakterien nicht in der Lage sind, untersucht wird, um die poröse Einsatz Membran während der Dauer der Studie zu durchdringen. Die Herstellung von bestimmten bakteriellen Komponenten über einen längeren Zeitraum kann die Integrität der Membran stören und den Durchtritt von Bakterien zu der unteren Kammer zu ermöglichen. Um festzustellen, ob dies ein potentielles Problem in dem System von Interesse ist, werden die Bakterienstämme untersucht können bei einer Reihe von Zeitpunkten in die obere Kammer der permeablen Membran insert-basiertes System angewendet werden. Zu jedem Zeitpunkt kann der Einsatz sorgfältig entfernt werden und das Medium von der unteren Kammer kann in einem Standardkolonie co gesammelt und verwendet werden,unting-Test (siehe Abschnitt 1.5). Wenn keine Kolonien aus dem Zellkulturmedium in der unteren Kammer ausgebildet sind, kann der Einsatz Membran angenommen werden, wirkungsvoll den Durchgang von Bakterien zu dem Zeitpunkt und bakterielle Belastung getestet werden verhindert.
Ein weiteres experimentelles Design-Komponente, die für die effektive Analyse der sekretierten bakteriellen Faktoren wahrscheinlich erfordern Optimierung ist die Multiplizität der Infektion (MOI). Das MOI bezieht sich auf das Verhältnis von Bakterienzellen pro Wirtszelle und daher durch Wirtszelle Konfluenz zum Zeitpunkt der Infektion und durch die Anzahl der Bakterienkolonie-bildenden Einheiten (CFU), die auf den Zellen beeinflusst wird. In diesen Studien wurden Keratinozyten-Zellen auf 90% Konfluenz gezüchtet, die diese Zellen erlaubt eine zusammenhängende Monoschicht mit intakten tight junctions zu bilden. Thoughtful Berücksichtigung der physiologischen Organisation der Wirtszellen untersucht werden soll, notwendig, eine geeignete Konfluenz für Infektionsversuche auszuwählen. Sobald ein appropriate Anzahl von Wirtszellen pro Vertiefung bestimmt wird, eine geeignete bakterielle CFU berechnet werden kann, um die gewünschte MOI basiert. In den Studien hier beschrieben wurde GAS angewendet Zellen bei einer MOI von 10. Entsprechende MOI hosten mit verschiedenen Bakterien und mit den gewünschten Follow-up-Analysen variieren. Ein niedriger Anfang MOI ist typischerweise physiologisch relevanten und ermöglicht die bakteriellen Faktor von Interesse langsam genug zu akkumulieren subtile Veränderungen in Wirtszellsignalisierung vor dramatischen Veränderungen in Wirtszelllebensfähigkeit zu erfassen, sind evident. Höhere MOIs werden in vielen Studien verwendet Zytotoxizität Beurteilung, aber dieser Effekt kann auch durch beginnend mit einer niedrigen MOI erreicht werden und damit die Infektion für einen längeren Zeitraum fortschreiten. Es ist wichtig, eine genaue CFU auf optische Dichte Folge zu bestimmen, die für alle Bakterienstämme getestet werden, wie isogenen Mutanten eine veränderte Wachstumsrate Wildtyp-Bakterien im Vergleich zu aufweisen können und erfordern daher, dass eine höhere oder niedrigere CFU pro Vertiefung zugegeben werden, umeinen angemessenen Vergleich der Host-Reaktion zwischen den Stämmen zu gewährleisten. In Fällen, in denen die Säugerwirtszellen, deren Wachstum von der Abtötung von Bakterien fähig sind oder Hemmen oder wenn nicht synchrone Wachstum zwischen Bakterienstämmen vermutet wird untersucht, kann es auch nützlich sein, Untersuchungen durchzuführen, die endgültige Bakterienlast am Ende der Infektionsperiode zu bewerten. Dies könnte durch Sammeln des Inhalts des durchlässigen Einsatzes erreicht werden und einen Koloniezählung Assay ähnlich dem in Abschnitt 1.5 des beschriebenen Verfahrens durchgeführt wird.
Auswählen geeigneter Größe Vertiefungen für den gewünschten Assay ist auch wichtig, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Durchlässigem Membran-Einsätze sind in einer Vielzahl von Größen zur Verfügung, aber die meisten konsistente Ergebnisse für die Studien hier gezeigten Darstellungen wurden unter Verwendung von Einsätzen ausgelegt für 24 gut und 6-Well-Gewebekulturplatten beobachtet. Diese Insertgrößen sind relativ einfach mit einer sterilen Pinzette zu handhaben, und die Leichtigkeit der Manipulation ist kritisch in Preventing unerwünschte Übertragung von Bakterien von der oberen Kammer zu der unteren Kammer des Brunnens. Für Experimente, die die Sammlung von Wirtszelllysaten beteiligt, 6-Well-Platten bieten eine geeignete Zellzahl pro Bedingung für die meisten Analysen und sind groß genug, Zellschaber für die Probenentnahme aufzunehmen. Für Zytotoxizitätstests in dem die Wirtszellen haften bleiben und werden mit einem fluoreszierenden oder kolorimetrischen Farbstoff markiert, der auf einem Plattenlesegerät (zB Ethidium Homodimer – Assay, Trypanblau-Ausschluss – Assay) gemessen werden kann, die Verwendung eines 24 – Well – Platte mit den entsprechenden Einsätzen ist empfohlen. Für Experimente , bei denen Zellkulturmedium gesammelt und analysiert werden (zB LDH – Freisetzung, Zytokin – Studien) entweder die 24 – Well – oder 6 – Well – Platten verwendet werden können, obwohl die kleineren Vertiefungen typischerweise eine ausreichende Probenvolumina für diese Analysen zur Verfügung stellen und die Nutzung der erforderlichen minimieren Reagenzien. Insgesamt ist das Verfahren sehr vielseitig und können nach Bedarf angepasst werden sampl vorzubereitenes für zahlreiche Folgeanträge.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.
Materials
| Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
| Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
| HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
| 10cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
| 6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| 24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
| Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
| Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
| Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
| Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
| Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
| Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
| Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
| Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500mL | |
| Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
| LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
| Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
| DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
| Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
| Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |
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