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면역학 및 감염병학

La mise en œuvre d'un système d'infection à base Insertion Perméable Membrane pour étudier les effets de sécrétées bactériennes Toxines sur des cellules hôtes mammaliennes

Published: August 19, 2016
doi:
10.3791/54406
,
1Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health,University of Notre Dame

Summary

Ici, un procédé utilisant un système d'infection sur la base d'insert perméable à la membrane pour étudier les effets de la Streptolysine S, une toxine sécrétée produite par Streptococcus du groupe A, est décrite sur les kératinocytes. Ce système peut être facilement appliquée à l'étude d'autres protéines bactériennes sécrétées sur divers types de cellules de l'hôte lors de l'infection.

Abstract

De nombreux agents pathogènes bactériens sécrètent des toxines puissantes pour aider à la destruction du tissu hôte, d'initier des changements de signalisation dans les cellules hôtes ou de manipuler les réponses du système immunitaire au cours de l'infection. Bien que les méthodes ont été développées pour purifier et produire avec succès plusieurs de ces facteurs de virulence importants, il y a encore beaucoup de toxines bactériennes dont la structure unique , ou d' importantes modifications post-traductionnelles les rendre difficiles à purifier et étudier dans des systèmes in vitro. En outre, même lorsque la toxine pure peut être obtenue, il y a de nombreux défis associés à l'étude des effets spécifiques d'une toxine dans des conditions physiologiques pertinents. La plupart des modèles de culture cellulaire in vitro visant à évaluer les effets des toxines bactériennes sécrétées sur les cellules hôtes impliquent l' incubation des cellules hôtes avec une dose unique de toxine. De telles méthodes mal rapproche ce fait des cellules hôtes une expérience au cours d'une infection, où la toxine est continuellement produit parles cellules bactériennes et on a laissé s'accumuler progressivement au cours de l'infection. Ce protocole décrit la conception d'un système d'infection bactérienne à base d'insert de membrane perméable pour étudier les effets de Streptolysin S, une toxine puissante produite par streptocoque du groupe A, sur les kératinocytes épithéliales humaines. Ce système imite plus étroitement l'environnement physiologique naturel lors d'une infection que les méthodes où la toxine pure ou surnageants bactériens sont directement appliqués à des cellules hôtes. Surtout, ce procédé élimine également le biais de réactions de l'hôte qui sont dues à un contact entre les bactéries et les cellules hôtes directe. Ce système a été utilisé pour évaluer efficacement les effets de Streptolysin S (SLS) sur l'intégrité de l'hôte de la membrane, la viabilité cellulaire, et les réponses de signalisation cellulaire. Cette technique peut être facilement appliquée à l'étude d'autres facteurs de virulence sécrétés sur une variété de types de cellules hôtes de mammifères pour étudier le rôle spécifique d'un facteur bactérien sécrétée dendant la durée de l'infection.

Introduction

La compréhension de la fonction des facteurs de virulence bactérienne dans le contexte de l'infection de la cellule hôte est un axe majeur de la recherche sur la pathogenèse bactérienne. De nombreux agents pathogènes bactériens sécrètent activement toxines et d' autres facteurs solubles pour faciliter la destruction du tissu hôte, d'initier des changements de signalisation dans les cellules hôtes ou pour manipuler les réponses du système immunitaire au cours de l' infection : 1 – 10. Bien que les méthodes ont été développées pour purifier succès et de produire un grand nombre de ces facteurs de virulence importants pour l' étude, certains produits bactériens ont des structures uniques ou d' importantes modifications post-traductionnelles qui en font des candidats récalcitrants pour les méthodes de purification et ne peuvent donc pas être étudiés de façon isolée en utilisant des systèmes in vitro . Par exemple, le groupe A Streptococcus, la bactérie pathogène responsable d'une myriade d'infections allant de la pharyngite à la fasciite nécrosante et syndrome de choc toxique, produit un sécrététoxine bactérienne connue sous le nom Streptolysin S (SLS) 11-17. Ce peptide produit ribosomally est codé par le cluster gène Streptolysin S associé (sag), et le produit mature est estimée à 2,7 kDa en taille 14-17. La protoxine, codée par SAGA, est modifié post-traductionnelle par plusieurs enzymes (AGAS, SAGC et SAGD) pour produire la forme mature, fonctionnelle 15 – 17. La complexité de ces modifications post-traductionnelles couplés avec la séquence d'acides aminés de la toxine inhabituelle ont rendu la toxine incompatible avec toutes purification et la structure des efforts de élucidation qui ont été tentées à ce jour , 15,17. Ces défis ont compliqué les efforts pour déterminer le rôle spécifique de cette toxine dans la pathogenèse de l'hôte.

Dans les cas où la préparation des toxines purifiées ou d'autres facteurs sécrétés est complexe ou pas possible, des mécanismesélucider la fonction de ces produits ont traditionnellement été étudié par la préparation de surnageants bactériens filtrés, qui sont ensuite appliqués à des cellules hôtes 18 – 20. Il y a plusieurs défis associés à cette technique. Tout d'abord, la plupart de ces facteurs sécrétés, y compris SLS, ne conservent pas une activité maximale ou uniforme lorsqu'ils sont stockés et appliqués à des cellules hôtes à un moment ultérieur. En outre, lorsque surnageants sont prélevés à un point de temps unique, puis appliqués à des cellules hôtes, il est difficile de déterminer la pertinence physiologique et de tirer des conclusions directes sur le processus d'infection naturelle, où les facteurs sécrétés sont autorisés à accumuler au cours de l'infection à un concentration physiologiquement pertinente. Ce second problème concerne non seulement l'utilisation de surnageants bactériens, mais aussi à l'utilisation de toxines purifiées dans des études de cellules hôtes 1 – 3,8. Pour répondre à ces questions, une inse membrane perméablesystème d'infection à base de rt a été développé pour évaluer les effets de SLS sur les cellules hôtes d'une manière qui maintient une activité de toxine optimale et élimine la variable de contact direct entre les bactéries et les cellules hôtes aussi. Dans ce système, les cellules épithéliales humaines sont cultivées en monocouche dans la chambre inférieure d'une chambre de deux puits, et les bactéries sont introduites dans la chambre supérieure du même puits. Une membrane poreuse (0,4 um pores) sépare les chambres supérieure et inférieure, ce qui permet des facteurs sécrétés à échanger entre les deux chambres, mais empêchant le passage des bactéries. Ce système a permis une évaluation efficace des réponses de l' hôte qui sont uniquement en raison de composants bactériens sécrétées durables tout en éliminant toutes les réponses qui peuvent se produire par contact direct au cours du groupe A infection streptococcique. Bien que d'autres facteurs bactériens sécrétées outre SLS peuvent également passer à travers la membrane poreuse, l'utilisation d'un groupe mutant isogénique y compris de type sauvage (WT), un SLS-knockout (ΔsagA) et une souche complémentée SAGA (ΔsagA + SAGA) permet une évaluation précise des réponses de l' hôte qui sont strictement SLS dépendantes 21.

Bien que des systèmes similaires d'insertion de la membrane perméable ont été utilisées pour l'étude des facteurs sécrétés impliqués dans les infections virales, la biologie du cancer, et la migration des cellules immunitaires 22-26, peu d' études portant sur ​​les interactions bactériennes avec les cellules hôtes ont utilisé cette approche 6,27,28. Même les études qui ont utilisé ces systèmes pour explorer les interactions entre les bactéries et les cellules hôtes ont principalement porté sur la migration des cellules inflammatoires ou des bactéries à travers une monocouche épithéliale ou endothéliale plaquée sur l'insert de membrane perméable. Le système d'une infection à base d'insert de membrane perméable décrite ici est un procédé simple et efficace qui repose sur la séparation des bactéries et des cellules hôtes par l'intermédiaire d'une membrane poreuse pour évaluer l'effeEVC de la toxine sécrétée, SLS, sur l'intégrité de la membrane de l'hôte, la viabilité cellulaire, la transduction du signal cellulaire, et des facteurs de cellules hôtes sécrétées. Cette technique peut être adaptée à l'étude d'autres facteurs de virulence sécrétés sur une variété de types de cellules hôtes de mammifères pour étudier le rôle d'un facteur bactérien spécifique au cours d'une infection.

Protocol

1. Culture bactérienne Générer des souches de mutants isogéniques à utiliser pour l'étude du facteur sécrété spécifique d'intérêt 21. Note: Les GASM1T1 5448 souches utilisées pour ces expériences incluses WT GAS, un chat SAGA Δ SLS-mutant déficient ( en abrégé dans le texte comme Δ SAGA), et une souche complémentée SAGA (abrégé dans le texte que Δ SAGA + SAGA) 21. Préparer des cultures liquides durant la nuit de souches bactériennes d'intérêt. Cultivez GAZ M1T1 5448 souches dans -10 ml de bouillon Todd-Hewitt à 37 ° C pendant 16-20 h avant d'infecter les cellules humaines. cultures centrifuger une nuit bactériennes (2.400 de rcf pendant 10 min) et resuspendre en milieu bactérienne fraîche. Remarque: La remise en suspension dans le même volume que les cultures d'une nuit ont été cultivées dans (5-10 ml), produit généralement une densité optique initiale souhaitable. Normaliser cultures bactériennes àLes concentrations de départ égales en diluant les cultures remises en suspension dans un milieu bactérien supplémentaire jusqu'à ce que la même densité optique à 600 nm (DO 600) est obtenu pour toutes les souches à tester (DO 600 d'environ 1,0 est recommandé pour plus de commodité). Remarque: Dans ces études, les cultures bactériennes en phase stationnaire ont été utilisés pour infecter des cellules hôtes immédiatement après la normalisation. Cependant, comme certaines souches de sortie de bactéries phase stationnaire nonsynchronously il peut être plus approprié pour commencer les infections d'accueil avec des cultures en phase de journal si cela se trouve être le cas pour les souches d'intérêt. Préalablement à une analyse plus poussée, effectuer un comptage des colonies essai pour déterminer les unités formant colonie (UFC) par ml, présent dans les cultures de départ de telle sorte que la multiplicité d'infection (MOI), ou le rapport des bactéries par cellule hôte, peuvent être déterminées. Préparer 1 ml des dilutions successives de cultures bactériennes qui ont été normalisés à la densification optique désiréeté dans un tampon phosphate salin (PBS) ou du milieu de croissance bactérienne approprié (bouillon de Todd-Hewitt a été utilisé dans ces études). Préparer des dilutions allant de 10 -1 à 10 -6 à produire au moins un ensemble de plaques d'agar avec des colonies dénombrables (30-300 colonies). Effectuer toutes les dilutions en triple. Transfert 100 ul de chaque dilution en série sur une plaque de gélose contenant du milieu approprié pour les espèces bactériennes en cours d'analyse. A noter: l'agar de Todd-Hewitt a été utilisé dans ces études. Utiliser un verre ou une matière plastique bactérienne épandeur afin de répartir uniformément l'aliquote de 100 pi sur toute la surface de la plaque de gélose, et continuer de se propager jusqu'à ce que le liquide ait été absorbé dans l'agar. Effectuer sous la flamme en utilisant une technique stérile. Incuber les plaques de gélose à 37 ° C pendant une nuit ou jusqu'à ce que des colonies apparaissent dénombrables. Compter les colonies qui poussent sur chaque assiette et calculer les UFC / ml dans la culture d'origine par la formu suivantela: nombre de colonies x inverse du volume de dilution / culture série plaquée en millilitres. par exemple (200 colonies x 1/10 -5 dilution) / 0,1 ml plaqué = 2,0 x 10 8 UFC / ml 2. Hôte Culture cellulaire Obtenir une ligne de cellule hôte appropriée pour les analyses souhaitées. Note: kératinocytes épithéliales humaines HaCaT 29, une sorte de cadeau V. Nizet, ont été utilisées pour ces études. Maintenir les cellules HaCaT dans des boîtes de culture de 100 mm de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec du sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur à 10% (FBS). Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. 3. Hôte cellulaire infection par Perméable système Insérer Membrane cellules en plaques dans des boîtes de culture de tissus appropriés et leur permettre de se développer jusqu'à ce qu'ils atteignent 90% de confluence. Remarque: Les cellules HaCaT utilisées dans ces études atteindre généralement confluence dans les 2-3 joursays après placage. Pour la collecte de lysat (par exemple , l' analyse et l' adénosine triphosphate (ATP) des essais de détermination de signalisation), la plaque cellules HaCaT en 6 plats de puits à une densité de semis d'environ 3 x 10 5 cellules / puits. Pour les expériences d'imagerie par immunofluorescence, les cellules de plaque sur des lamelles de verre stériles à l' intérieur des plats 6 puits à une densité d'ensemencement d'environ 3 x 10 5 cellules / puits. Pour éthidium perméabilisation membranaire homodimère et lactate déshydrogénase (LDH) des essais de libération, plaque cellules HaCaT dans 24 puits à une densité de semis d'environ 5 x 10 4 cellules / puits. Immédiatement avant le traitement, laver les cellules avec 1x PBS stérile. Appliquer milieu de croissance frais aux cellules. Pour les conditions décrites ici, appliquer 2 ml de milieu par puits pour 6 plaques de puits ou 0,5 ml de milieu par puits pour 24 plaques à puits. Si les traitements pharmacologiques sont testés, mélanger avec du milieu frais et appliquer pendant cette step. Remarque: Certains tests peuvent nécessiter des médias alternatifs. Par exemple, comme le phénol concentrations sériques rouge et élevée interférer avec le dosage de la LDH de libération, le phénol DMEM exempt de rouge additionné de 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) (p / v), 2 mM de L-glutamine et pyruvate de sodium 1 mM était utilisé pour ces expériences. Après un milieu frais a été appliqué, placer soigneusement 0,4 um perméable insert de membrane stérile dans chaque puits. Effectuez cette étape dans une hotte à flux laminaire, et utiliser des pinces stériles pour transférer l'insert de membrane perméable dans chaque puits. Appliquer un milieu de culture de cellules fraîches à la chambre supérieure de chaque puits, selon les instructions du fabricant. Pour les conditions décrites ici, appliquer 1 ml de milieu par puits pour 6 plaques de puits ou 0,1 ml de milieu par puits pour 24 plaques à puits. Appliquer un volume approprié de cultures bactériennes normalisées (voir la section 1) à la chambre supérieure du système d'insertion de la membrane perméable. Utiliser le milieu bactérien pour Contr non infectétraitements ol. Pour les résultats décrits ici, ajouter 25 pi des cultures normalisées par chambre pour plaques à 24 puits et ajouter 100 pi des cultures par chambre pour plaques de 6 puits. Remarque: Dans ces études, de type sauvage ou mutant GAS a été appliqué à des cellules hôtes à une MOI de 10. MOI a été calculée en se basant sur ​​le nombre final de cellules eucaryotes (par exemple , 2 x 10 6 cellules / puits), de telle sorte que 10 fois plus de bactéries ont été ajoutés par la cellule hôte au début de la période d'infection (par exemple , 2 x 10 7 UFC par puits). MOI approprié variera en fonction des différentes espèces bactériennes et les analyses de suivi souhaitées. Remarque: En plus d'utiliser milieu bactérien pour les contrôles non infectés, d'autres contrôles utiles pour certaines applications de cette technique peuvent inclure des bactéries tuées par la chaleur ou milieu bactérien passé à titre de comparaison. Incuber les cellules infectées à 37 ° C avec 5% de CO 2. Collection 4. Sample <ol> À recueillir le milieu de culture de cellules, des lysats de cellules hôtes, ou des lamelles de verre avec des cellules intactes pour le suivi des analyses, commencer par enlever soigneusement la plaquette de membrane perméable à l'aide de pinces stériles. Pour l'évaluation des protiens hôtes sécrétées: Recueillir le moyen de la chambre inférieure en tubes de 1,5 ml. Éviter de perturber la monocouche lors de la collecte. Centrifuger les échantillons à 14000 rcf pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. Retirez tous, mais 50 ul du surnageant dans un tube de 1,5 ml frais et conserver à -20 ° C ou utiliser immédiatement. Pour l'évaluation de la cellule hôte Lystates: Aspirer le milieu au-dessus de la monocouche de cellules hôtes. Éviter de perturber la monocouche, car cela pourrait entraîner la perte de l'échantillon. Rincer les cellules une fois avec PBS 1x. Aspirer doucement PBS. Appliquer immédiatement un volume approprié de tampon de lyse glacé pour obtenir la concentration de protéine désirée, et incuber laéchantillons sur la glace pendant 15 min. Appliquer entre 200 pl et 350 pl de tampon de lyse par puits de chaque plaque 6 puits pour obtenir des concentrations en protéines comprise entre 0,5 et 1,5 mg / ml. Remarque: Le tampon de lyse utilisé dans ces études était composé d'eau déminéralisée, 1% (v / v) en remplacement de Nonidet P40, un cocktail d'inhibiteurs de la phosphatase, et un cocktail d'inhibiteurs de protéase. Des réactifs spécifiques sont énumérés dans la section Matériel et équipement. Utiliser un gratteur de cellules pour détacher les cellules de la surface de la plaque de chaque puits et la pipette tout le contenu de chaque puits dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger les échantillons à 14000 rcf pendant 20 min à 4 ° C. Pour évaluer les composants de lysats solubles, éliminer le surnageant dans un nouveau tube et conserver à -20 ° C ou utiliser immédiatement. Pour évaluer les composants de lysats insolubles nucléaires ou autres, réserver le culot et conserver à -20 ° C ou utiliser immédiatement. Pour l'évaluation par immunofluorescence Imaging: Commemilieu de pirate et laver les cellules dans 1x PBS froid. Fixer les cellules pendant une nuit à 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS (p / v). Note: Dans ces études, a été ajouté par puits de chaque plaque 6 puits 1 ml de PFA. 5. Applications suggérées Hôte Signal transduction Analyse par SDS-PAGE et Western blot Collecter des lysats de cellules hôtes comme décrit dans la section 4.3. Déterminer la concentration en protéine de chaque échantillon de lysat par de l' acide bicinchoninique (BCA) ou en utilisant des étalons de protéines équivalentes 30. Normaliser les concentrations en protéines entre les échantillons avant le chargement et l' exécution des échantillons sur un gel de Polyacrylamide à 4-15% ou de 31 remplacement approprié. Normaliser les concentrations d'échantillons par pipetage la même quantité de protéine provenant de chaque échantillon (par exemple , 20 pg) dans un nouveau tube de 1,5 ml et en ajoutant des volumes variables de tampon de lyse (tampon volume = volume total de l' échantillon – volumeajoutée) à chaque tube pour porter le volume total (par exemple 50 pi) et concentration finale équivalente en protéines entre les échantillons. Des échantillons de transfert à un fluorure de polyvinylidène (PVDF) (ou équivalent). Les résultats présentés ici, le transfert des échantillons à 25 volts pendant 2 heures avant d'augmenter la tension de 70 volts pendant 45 min supplémentaires. Utiliser un tampon de transfert composée de 200 mM de base Tris, 1,5 M de glycine et 20% de méthanol (v / v) dans de l'eau déminéralisée. Les membranes de bloc dans 5% de BSA + 0,1% de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS). Ajuster en conséquence en fonction des recommandations du fabricant pour l'anticorps à utiliser. Incuber membranes avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. Utilisation chez le fabricant de dilution recommandée. Laver les membranes pendant 1,5 heure dans du TBS + 0,1% de Tween 20; rafraîchir tampon toutes les 10-15 min. Incuber avec la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à l'anticorps secondaire à une dilution de 1: 5000 pendant 1,5 heure à la salle temperature. Laver les membranes pendant 1,5 heure dans du TBS + 0,1% de Tween 20; rafraîchir tampon toutes les 10 – 15 min. Incuber les membranes avec un réactif de détection de chimioluminescence avant de développer le film selon les instructions du fabricant. D'autres procédés de détection peuvent être utilisés comme souhaité. Cellule hôte immunofluorescence et imagerie Fixer des lamelles contenant des cellules hôtes comme décrit dans la section 4.4. Retirer solution PFA et laver les lamelles contenant les cellules traitées deux fois dans du PBS, l'aspiration entre les lavages. Remarque: PFA est très toxique et doit être éliminé de manière appropriée. Bloquer les lamelles pendant 2 heures à la température ambiante dans du PBS avec 1% (p / v) de sérum de chèvre normal à 2% (v / v) de Triton X-100 et 0,5% (v / v) de Tween 20. Laver les lamelles avec du PBS pendant 30 min, de rafraîchir la mémoire tampon toutes les 10 min. Incuber les lamelles avec l'anticorps primaire dans un rapport 1:50 (ou tel que recommandé par le fabricant) dans le blocage de solution nuit à 4 ° C. Laver les lamelles pendant 1,5 heure dans du PBS, rafraîchissant la mémoire tampon toutes les 30 min. Incuber les lamelles pendant 2 heures à la température ambiante dans l'anticorps secondaire (chèvre anti-IgG de lapin AlexaFluor488 a été utilisée pour ces études) en utilisant un rapport 1: 200 d'anticorps à une solution de blocage. Laver lamelles de pendant 1 heure, rafraîchissant la mémoire tampon toutes les 20 min. Appliquer les taches souhaitées. Note: Ces études utilisées DAPI (Teinture nucléaire) et la rhodamine-phalloïdine (actine tache) à des rapports de 1: 1000 dans une solution de blocage. Incuber avec des lamelles couvre-taches nucléaires et actine pendant 30 min à température ambiante. Laver les lamelles dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, le rafraîchissement du tampon toutes les 10 min. Monter les lamelles sur des lames de verre en utilisant un milieu de montage. Laisser lamelles pour régler sur les lames pendant une nuit avant le scellement et l'imagerie. Pour les résultats décrits ici, recueillir des images sur une usi fluorescence au microscopeng un objectif 20X standard. Utilisez ImageJ et l'imagerie par microscope logiciel pour traiter les images capturées. Éthidium homodimère mort cellulaire Assay Aspirer le milieu de chaque lavage bien et cellules deux fois avec du PBS stérile. Appliquer 4 uM éthidium homodimère-1 dans du PBS. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité. Déterminer le niveau de fluorescence à l'aide d'un lecteur de plaque fixé à 528 nm d'excitation et d'émission 617 nm avec une valeur de coupure de 590 nm. Ajouter 0,1% (p / v) saponine à chaque puits après la lecture initiale et laisser la plaque incuber pendant 20 minutes supplémentaires à la température ambiante (avec basculement) avant de lire la plaque une deuxième fois avec les mêmes réglages. Déterminer pour cent membrane perméabilisation individuellement pour chaque puits en divisant la fluorescence initiale de lecture (post-traitement) par la deuxième lecture de fluorescence (post-saponine). ATP Détermination Assay <li> Collecter lysats comme décrit au paragraphe 4.3 ci-dessus. Normaliser les niveaux de protéines dans les lysats par dosage BCA ou similaire 30. Déterminer les taux d'ATP cellulaire en utilisant un kit de détermination de l'ATP à base luminescence ou équivalent, selon les instructions du fabricant. Normaliser les valeurs traitées pour les échantillons témoins non infectés correspondants. LDH Essai de sortie Après l'infection, recueillir surnageants comme décrit dans la section 4.3. Évaluer la libération de LDH en utilisant un kit de détection de cytotoxicité pour la libération de LDH selon les instructions du fabricant.

Representative Results

Le protocole de système d'infection à base insérer une membrane perméable au point pour l'étude des facteurs bactériennes sécrétées est détaillé dans la figure 1. Ce système repose sur la séparation des bactéries et des cellules hôtes par l' intermédiaire d' une membrane poreuse pour évaluer les effets des facteurs bactériennes sécrétées, dans ce cas streptolysine S (SLS), sur les réponses de l' hôte telles que l' intégrité de l' hôte de la membrane, la viabilité cellulaire, la transduction du signal cellulaire, et des facteurs de cellules hôtes sécrétées. la figure 2 fournit des données Western Blot représentatifs démontrant que ce système peut être utilisé pour évaluer les changements dans l'activation des contacts -indépendante signalisation hôtes protéines. Plus précisément, les données représentatives montrent nettement amélioré l'activation de la MAPK p38 en présence de souches productrices GAS SLS. Ce système peut également être appliquée pour visualiser les effets des facteurs bactériens sécrétées sur la protéine hôte localisation par microscopie immunofluorescence (<strong> Figure 3). Les données montrent l' activation du médiateur inflammatoire clé du facteur nucléaire kappa B (NFkB), qui subit une translocation du cytoplasme vers le noyau lors de l' activation 21 SLS-dépendant. Les résultats présentés dans les figures 2 et 3 indiquent que les réponses SLS-dépendantes de signalisation inflammatoires ne nécessitent pas de contact direct entre les bactéries et les cellules hôtes. Comme les expériences précédentes ont déjà démontré SLS-dépendante p38 et activation NFkB dans des modèles d'infection directe 21, des niveaux similaires de p38 ou de l' activation NFkB parmi les trois souches de gaz dans le système à base d'insert-membrane perméable auraient indiqué que la réponse nécessaire contact direct entre le les bactéries et les cellules hôtes. la figure 4 montre que ce système d'infection peut être utilisée pour évaluer les changements de la toxine dépendant de la cytotoxicité hôte par l' intermédiaire d' éthidium homodimère et la libération de LDH essais. Ceci est démontré par l'augmentation significative in fois la perméabilisation de la membrane et la libération de LDH par les cellules hôtes exposées aux souches de gaz contenant du SLS par rapport à des cellules non infectées ou des cellules exposées à la souche déficiente SLS. Ces changements dans la cytotoxicité ne sont pas immédiats, comme des effets significatifs ne sont pas évidents jusqu'à ce que l'infection post-12 h dans le cas de perméabilisation de la membrane et 16 h dans le cas de la libération de LDH. Les données représentatives illustrent l'importance de choisir des points de temps appropriés et les conditions d'infection pour l'évaluation de ces réponses de l'hôte. En plus de permettre à l'évaluation de l' hôte de signalisation des changements et la cytotoxicité, le système d'infection sur la base de l' insert de la membrane perméable est applicable à l'étude des changements métaboliques tels que la détermination précise des niveaux d'ATP hôte en empêchant la contamination bactérienne des lysats de cellules hôtes (Figure 5) . Ces données montrent une perte significative de l'ATP des kératinocytes en réponse à une infection de gaz en 16 heures après l'infection, avec une perte accrue d'ATP in la présence de SLS. Ces résultats sont cohérents avec les augmentations de toxine dépendante observées dans l'hôte de signalisation de stress-réponse et la cytotoxicité. Figure 1: Protocole système des infections Schéma de Permeable Membrane Insert-Based pour évaluer les effets des facteurs bactériennes sécrétées sur les cellules hôtes kératinocytes humains sont plaquées dans le compartiment inférieur et cultivées à 90% de confluence.. Une membrane enduite de collagène de 0,4 um pores sépare les chambres supérieure et inférieure, et les bactéries sont ajoutées à la chambre supérieure du système d'insertion de la membrane perméable pour la période d'infection souhaitée. Surnageants de culture cellulaire et les cellules hôtes peuvent être recueillies après la période d'infection et utilisés pour une variété d'analyses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre. Figure 2:. Le système d'infection Permeable Membrane Insert-Based peut être utilisé pour la cellule hôte Lysate Analyse par SDS-PAGE et Western blot Les données représentatives démontrent que SLS améliore l' activation de la voie p38 MAPK dans les kératinocytes infectés. (A) HaCaTs ont été infectées avec GAS pendant 7 heures au moyen du système d'infection d'insertion de la membrane perméable (à une MOI = 10) et les lysats ont été évalués pour l' activation de la p38. (B) densitométrie de trois Blots occidentale indépendante a été réalisée pour quantifier l'activation relative de p38 en réponse à GAS'infection. Moyennes de trois répétitions biologiques sont présentés, avec des barres d'erreur représentent l'écart type. activation relative de p38 est représentée comme niveau de protéine phosphorylée / total. La signification statistique a été déterminée par rapport àles cellules non infectées. La p-valeur globale a été déterminée par ANOVA (p = 0,0063). Les tests de Dunnett ont été effectuées a posteriori pour comparer chaque condition au contrôle non infecté moyenne correspondante. *, P = 0,01-0,05; ** P = 0,001 à 0,01; ***, P = de 0,0001 à 0,001; **** P <0,0001. Ce chiffre a été modifié depuis Flaherty et al. 2015 21. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3:. Le système d'infection Permeable Membrane Insert-Based Permet la visualisation de l' hôte de signalisation Modifications par immunofluorescence Microscopie Les données représentatives montrent que Streptolysin S améliore la signalisation pro-inflammatoire par l' activation de NFkB. HaCaT kératinocytes humains ont été infectés par le GAS à un M OI de 10 pendant 8 heures en utilisant le système d'infection à base d'insert de membrane perméable. (A et B) localisation nucléaire de NFkB a été évaluée par imagerie par immunofluorescence. Le pourcentage de cellules localisées nucléaires a été calculé en comptant le nombre de cellules dans lesquelles NFkB a subi une translocation du cytoplasme vers le noyau d'un domaine donné et en divisant ce nombre par le nombre total de cellules pour le même champ. Les barres d'échelle indiquent 100 um. (A) La moyenne de trois répétitions biologiques sont représentés pour chaque état ​​avec des barres d'erreur représentent l' écart type. La p-valeur globale a été déterminée par ANOVA; p <0,0001. Les essais ont été effectués de Dunnett pour comparer chaque condition de la condition de contrôle non infecté correspondante. *, P = 0,01-0,05; ** P = 0,001 à 0,01; ***, P = de 0,0001 à 0,001; **** P <0,0001. Ce chiffre a été modifié depuis Flaherty et al. , 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4:. Le système d'infection Permeable Membrane Insert-Based permet la détermination des bactéries-Mediated Membrane perméabilisation et cytotoxicité en l'absence de contact direct entre les bactéries et les cellules hôtes Les données représentatives démontrent que kératinocytes viabilité diminue en présence de la toxine SLS actif . GAZ – la mort cellulaire induite a été évaluée dans les cellules HaCaT en présence du WT, GAS SLS-déficient ou SAGA complété kératinocytes ont été exposés à GAS utilisant le système d'infection à base d'insert-membrane perméable à 8-16 h à une MOI de 10. (. A) la viabilité a été évaluée par un dosage éthidium homodimère ou (B) la libération de LDH test. Dans les deux panneaux, 3 reOn fait la moyenne et complique la barres d'erreur représentent l'écart type. Importance pour chaque point de temps a été déterminée par ANOVA (A) 8 h, p = 0,0241; 12 h, p <0,0001 (B) 8 h, p = 0,0287; 12 h, p = 0,1977; 16 h, p = 0,0031. Les tests de Dunnett ont été effectués pour comparer les moyennes de chaque condition à l'infection de type sauvage pour le point de temps correspondant. *, P = 0,01-0,05; ** P = 0,001 à 0,01; ***, P = de 0,0001 à 0,001; **** P <0,0001. Ce chiffre a été modifié depuis Flaherty et al. 2015 21. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5: Le système d'infection Perméable Membrane Insert-Based Permet la détermination précise des niveaux d'ATP hôte par Prévention Bacterial Contamination de la cellule hôte lysats. Les données représentatives démontrent SLS dépendantes perte de l' ATP au cours du groupe A infection streptococcique. cellules HaCaT ont été infectées avec GAS 8-16 h en utilisant le système d'infection à base d'insert de membrane perméable. Réplicats techniques (n = 3) à partir d' une répliquée biologique représentatif (2 x 10 6 cellules par échantillon) ont été moyennées pour chaque état, avec des barres d'erreur représentent l' écart type. Les p-valeurs globales ont été déterminées par analyse de variance (12 h, p <0,0001; 16 h, p <0,0001). Les tests de Dunnett ont été effectués pour comparer chaque état avec une infection de type sauvage pour le point de temps correspondant. *, P = 0,01-0,05; ** P = 0,001 à 0,01; ***, P = de 0,0001 à 0,001; **** P <0,0001. Ce chiffre a été modifié depuis Flaherty et al. 2015 21. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici est décrit un procédé utilisant un système d'infection à base d'insert perméable membrane pour examiner les effets de la toxine bactérienne Streptolysin S sur des kératinocytes épithéliales humaines dans un système in vitro. Ce protocole peut être adapté pour l'étude d'autres facteurs de virulence bactériennes sécrétées, ainsi que les types de cellules hôtes alternatifs. Ce système récemment mis au point présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes expérimentales qui utilisent des toxines bactériennes purifiées ou des surnageants filtrés 1 – 3,8,18 – 20. Le système à base d'insert de membrane perméable fournit une dose maintenue constante de la toxine bactérienne correspondant à des cellules hôtes lorsqu'il est produit, ce qui permet une activité maximale de la toxine doit être maintenue et augmente également la cohérence entre les expériences. En outre, ce système imite plus étroitement les conditions physiologiques en permettant le facteur sécrété d'accumuler au fil du temps que l'infection progresse et par eliminaires la nécessité de sélectionner arbitrairement des concentrations spécifiques de la toxine à appliquer à des cellules hôtes. En outre, ce système fournit aussi des moyens pour les chercheurs pour déterminer si un facteur bactérien d'intérêt est délivré aux cellules hôtes d'une manière dépendante de contact. La dépendance de contact est souvent testée par la génération de mutants bactériens isogéniques déficients en adhérence ou par l'utilisation de réactifs qui empêchent l'adhérence. Le système décrit ici fournirait une alternative simple pour compléter ou remplacer ces approches traditionnelles.

En plus des applications testées décrites à l'article 5 du protocole, d'autres applications pour lesquelles ce système d'infection pourrait être facilement adapté comprennent la collecte d'échantillons pour les tableaux de cytokines et des tests ELISA. Dans ces deux cas, un protocole similaire à celui décrit pour la LDH des tests de libération peut être suivie. Bien que non représenté, ce système a été utilisé pour collecter efficacement des échantillons de cellules hôtes d'êtrenalyzed par cytométrie de flux. Dans cette application, l'insert de membrane perméable est éliminé après la période d'infection, les cellules sont lavées pour éliminer le milieu de culture cellulaire, et de la trypsine est appliquée pour permettre la collecte des cellules pour l'analyse. La séparation physique des bactéries à partir des cellules hôtes est particulièrement utile pour cette application, car il aide à éviter la formation de gros agrégats constitués de bactéries adhérentes et les cellules hôtes qui pourraient autrement interférer avec le comptage précis des cellules par le cytomètre de flux.

Bien que les réponses d'accueil très cohérents ont été observés lorsque l'on compare les résultats des études d'infection de la membrane perméable à base insert-avec des études d'infection directe traditionnels, des différences notables dans la cinétique de ces réponses de l' hôte ont été observées 21. Par exemple, des changements dans la signalisation de l'hôte et d'une membrane à base de cytotoxicité prennent 30 à 50% plus longue à se produire dans le modèle d'infection en fonction d'insertion de la membrane perméable que corrépondre modèles d'infection directe. Étant donné que le système à base d'insertion de membrane perméable nécessite moyenne à appliquer sur les compartiments supérieur et inférieur de chaque puits, le système mis au point pour les études décrites ici exige une augmentation de 30% en volume du milieu total par puits par rapport aux correspondants des modèles d'infection directe utilisée antérieurement 21. Cette différence de volume du milieu total, couplée à la distance accrue entre les bactéries et les cellules hôtes si le contact direct est interdit, probablement augmente le temps nécessaire pour SLS à diffuser à travers le moyen d'atteindre les cellules hôtes et de susciter des effets observés. En outre, le système à base d'insert de membrane perméable élimine de nombreux facteurs de virulence GAS qui sont susceptibles de contribuer à accueillir les dommages cellulaires; l'absence de ces facteurs supplémentaires dans ce système est également susceptible de contribuer au retard dans l' hôte la mort cellulaire et l' initiation de la signalisation hôte des événements par rapport à l' infection directe 21. Ces facteurs doivent être considéréslors de la conception des expériences pour évaluer d'autres composants bactériennes sécrétées.

Pour identifier les conditions les plus significatives pour tester les effets des facteurs bactériens sécrétées sur les cellules hôtes, tester une gamme de points de temps pour chaque application du système de l'infection à base d'insert-membrane perméable est recommandée. Il est important de considérer dans quelles conditions le facteur de virulence d'intérêt spécifique est optimale produits (par exemple , la phase logarithmique, phase stationnaire, en réponse à certains signaux de l' environnement, etc.) afin d'observer avec succès ses effets. Dans les expériences ont porté sur l' évaluation des changements dans les protéines de signalisation d'accueil, il était nécessaire de sélectionner des points de temps qui a permis un temps suffisant pour SLS pour atteindre les cellules hôtes et à produire en quantités suffisantes pour induire la signalisation change 21. Dans le même temps, l'évaluation de l'évolution des besoins de signalisation hôte qui doit être effectuée avant SLS induite par perméabilisation de la membrane, car cet effet complicates la collecte des lysats de cellules hôtes pour l'analyse. La mort cellulaire induite par SLS pourrait être optimale observée dans les deux modèles d'infection en fonction insert-membrane directe et perméable plusieurs heures après le début des événements de signalisation signalés 21. En outre, en sélectionnant les points de temps d'intérêt, il est également important de veiller à ce que les bactéries étudiées sont incapables de pénétrer la membrane d'insert poreux pendant la période d'étude. La production de certains composants bactériens sur une période prolongée peut perturber l'intégrité de la membrane et permettre le passage des bactéries dans le compartiment inférieur. Pour déterminer si ce problème potentiel dans le système d'intérêt, les souches bactériennes à étudier peuvent être appliquées à la chambre supérieure du système à base d'insert de membrane perméable à un intervalle de points de temps. A chaque point de temps, l'insert peut être enlevé avec précaution et le milieu de la chambre inférieure peut être recueillie et utilisée dans un co-type de coloniestest CHASSE (voir section 1.5). Si aucune des colonies sont formées à partir du milieu de culture cellulaire dans le compartiment inférieur, la membrane d'insert peut être supposée empêcher efficacement le passage des bactéries au point de temps et de la charge bactérienne testée.

Un autre composant de la conception expérimentale qui est susceptible de nécessiter une optimisation pour une analyse efficace des facteurs sécrétés de bactéries est la multiplicité d'infection (MOI). MOI se réfère au rapport des cellules bactériennes par la cellule hôte, et est donc influencée par la confluence de la cellule hôte, au moment de l'infection et par le nombre d'unités formant colonie de bactéries (CFU) appliquée aux cellules. Dans ces études, les cellules de kératinocytes ont été cultivées jusqu'à 90% de confluence, ce qui a permis à ces cellules forment une monocouche cohérente avec les jonctions serrées intactes. Réfléchi examen de l'organisation physiologique des cellules hôtes à étudier est nécessaire pour sélectionner une confluence appropriée pour des expériences d'infection. Une fois qu'un approprnombre iate de cellules hôtes par puits est déterminée, une CFU bactérienne appropriée peut être calculée en fonction de la MOI souhaitée. Dans les études décrites ici, GAS a été appliqué à des cellules hôtes à une MOI de 10. MOI appropriée variera en fonction des bactéries différentes et avec les analyses de suivi souhaitées. Un faible début MOI est généralement plus physiologiquement pertinents et permet le facteur bactérien d'intérêt à accumuler assez lentement pour capturer des changements subtils dans la signalisation de la cellule hôte avant que des changements dramatiques dans la viabilité de la cellule hôte sont évidents. IAM plus élevés sont utilisés dans de nombreuses études évaluant la cytotoxicité, mais cet effet peut également être réalisé en commençant par un faible MOI et permettant l'infection de progresser pendant une période de temps plus longue. Il est important de déterminer une UFC précise pour corollaire de densité optique pour toutes les souches bactériennes à tester, sous forme de mutants isogéniques peuvent avoir un taux de croissance modifié par rapport à des bactéries de type sauvage, et peut donc exiger qu'un UFC supérieur ou inférieur est ajouté par puitsassurer une comparaison appropriée de la réponse de l'hôte entre les souches. Dans les cas où les cellules hôtes de mammifères étudiées sont capables de tuer les bactéries ou inhiber leur croissance, ou si l'on soupçonne une croissance non synchrone entre des souches bactériennes, il peut également être utile d'effectuer des études pour évaluer la charge bactérienne finale à la fin de la période d'infection. Ceci pourrait être accompli en recueillant le contenu de l'élément perméable et en effectuant un essai de colonie de comptage semblable à celle qui est décrite dans la section 1.5 de la procédure.

La sélection de puits de taille appropriée pour le dosage souhaité est également importante pour obtenir des résultats optimaux. des inserts de membrane perméable sont disponibles dans une variété de tailles, mais les résultats les plus constants pour les études présentées ici ont été observées en utilisant des inserts destinés à 24 puits et 6 puits des plaques de culture tissulaire. Ces tailles d'insert sont relativement faciles à manipuler avec des pinces stériles, et la facilité de manipulation est critique dans preventing transfert indésirable de bactéries du compartiment supérieur au compartiment inférieur du puits. Pour les expériences impliquant la collecte de lysats de cellules hôtes, 6 plats et fournissent un numéro de cellule appropriée par condition pour la plupart des analyses et sont assez grand pour accueillir des grattoirs de cellules pour la collecte des échantillons. Pour les tests de cytotoxicité dans lequel les cellules hôtes restent adhérentes et sont marqués avec un colorant fluorescent ou colorimétrique qui peut être mesurée sur un lecteur de plaque (par exemple éthidium dosage homodimère, test d'exclusion au bleu trypan), l' utilisation d'une plaque de 24 puits avec les inserts correspondants est conseillé. Pour des expériences dans lesquelles le milieu de culture cellulaire seront collectées et analysées (par exemple la libération de LDH, des études de cytokines) , soit le 24 puits ou plaques de 6 puits peuvent être utilisés, bien que les plus petits puits fournissent généralement des volumes d'échantillons adéquats pour ces analyses et de minimiser l' utilisation du nécessaire réactifs. Dans l'ensemble, la méthode est très polyvalent et peut être adapté selon les besoins pour préparer samples pour de nombreuses applications de suivi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.

Materials

Todd-Hewitt broth Acumedia 7161A Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer Eppendorf basic model Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. 
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713 Other brands are suitable.
Agar Sigma A1296-1kg Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073 Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest S162H Use appropriate media additives for cell line of interest.
10cm tissue culture dishes Nunc 150350 Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7506 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7524 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips Fisherbrand 12-541-B These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023
Phenol Red Free DMEM Life Technologies 31053028 Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
L-glutamine Gibco 25030149 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate Gibco BP356100 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) Corning 3540
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) Corning 3595
Forceps Fisher 3120018 These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers Fisherbrand 08-100-241 These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500 TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit Pierce 23227 Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels BioRad 4561083 Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies BioRad 1658063 Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply BioRad 1645050 Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette BioRad Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane EMD Millipore IPVH00010 Only required for Western Blotting.
Tween 20 Sigma P1379-500mL
Rabbit IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2030 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Mouse IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2031 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody Cell Signaling 4511 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody Cell Signaling 8690 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 Molecular Probes A-11034 Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent KPL 54-61-00 Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film Biodot BDB57 Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope Nikon Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum Thermo Scientific 31873
Triton X-100 Sigma T9284-500mL
DAPI nuclear stain Cell Signaling 4083 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain Molecular Probes R415 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1 Molecular Probes E1169 Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader Molecular Devices Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin Sigma 47036-50G-F Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit Life Technologies A22066 Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release Roche 11644793001 Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute Sigma 74385-1L Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78420B Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free Sigma S8830-2TAB Other cocktails are likely to be suitable.
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References

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Flaherty, R. A., Lee, S. W. Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells. J. Vis. Exp. (114), e54406, doi:10.3791/54406 (2016).
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