Flow-Sortierung und Exome Sequenzierung der Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms
Summary
Hier beschreiben wir ein kombiniertes Durchflusszytometrisches Zellsortier- und Low-Input-Bibliothekskonstruktionsprotokoll der nächsten Generation, das für die Herstellung von hochwertigen, exakt exakten Daten aus den Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms (CHL) entwickelt wurde.
Abstract
Die Hodgkin-Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms sind im Hintergrund von entzündlichen Lymphozyten spärlich verteilt und enthalten typischerweise weniger als 1% der Tumormasse. Material, das aus Massen-Tumor gewonnen wird, enthält den Tumorgehalt in einer für die Charakterisierung unzureichenden Konzentration. Daher wird hier die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit acht Antikörpern sowie Neben- und Vorwärtsstreuung als Verfahren zur schnellen Trennung und Konzentration von hochreinen Tausenden von HRS-Zellen aus dem Tumor für die anschließende Untersuchung beschrieben. Zur gleichen Zeit, weil Standard-Protokolle für Exome-Sequenzierung in der Regel benötigen 100-1000 ng Eingangs-DNA, die oft zu hoch ist, auch mit Flow-Sortierung, bieten wir auch eine optimierte, Low-Input-Bibliothek Bau-Protokoll in der Lage, qualitativ hochwertige Daten von so wenig wie 10 ng Eingangs-DNA. Diese Kombination ist in der Lage, Bibliotheken der nächsten Generation zu produzieren, die für die Hybridisierung von Ganzkörper e geeignet sindXome Köder oder mehr fokussierte Zielpaneele, wie gewünscht. Exome-Sequenzierung der HRS-Zellen, wenn sie mit gesunden intratumoralen T- oder B-Zellen verglichen werden, können somatische Veränderungen, einschließlich Mutationen, Insertionen und Deletionen, und Kopienzahländerungen identifizieren. Diese Erkenntnisse erläutern die Molekularbiologie von HRS-Zellen und können Wege für gezielte Arzneimittelbehandlungen zeigen.
Introduction
Fortschritte in der Krebsgenomik als Folge der Sequenzierung der nächsten Generation führten zu signifikanten Durchbrüchen bei der Identifizierung von therapeutischen Targets und bei der Prognose für viele hämatologische und nicht-hämatologische Neoplasien. Neue individualisierte Behandlungsstrategien, die auf spezifischen genomischen Veränderungen basieren, werden in vielen Tumortypen schnell eingeführt (in den Referenzen 1 , 2 ). Trotz signifikanter Fortschritte bei der Lymphom-Genomik war das Genom der neoplastischen HRS-Zellen im klassischen Hodgkin-Lymphom (CHL) unerklärt. Die Untersuchungen wurden durch die Knappheit von neoplastischen HRS-Zellen in einer reaktiven Mikroumgebung behindert, was es schwierig macht, gereinigte HRS-Zellpopulationen zu isolieren 3 .
Das Verfahren zur Isolierung lebensfähiger HRS-Zellen aus Primärtumoren wurde von Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. Das Verfahren verwendet einen Acht-Antikörper-Cocktail, bestehend aus CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 und CD64, um HRS-Zellen aus einer CHL-Tumorsuspension eindeutig zu identifizieren Sind in der Lage, mindestens 1000 lebensfähige HRS-Zellen aus frischen oder gefrorenen Zellsuspensionen aus Tumorbiopsien zu isolieren, die aus mindestens 10 7 Zellen bestehen (ca. 10 mg Gewebe). Die Reinheit ist größer als 90% durch Durchflusszytometrieanalyse und wird geschätzt Mindestens 80% durch exome genomische Analyse von zehn aufeinander folgenden Fällen.
Wir haben eine Durchflusszytometrische Zellisolationstechnik verfeinert, die den Prozess stark erleichtert hat, was die schnelle Isolierung von Tausenden von lebensfähigen HRS-Zellen aus primären CHL-Tumoren ermöglicht. Wir haben die Technik verwendet, um zu produzieren, was geglaubt wird, um die erste Voll-Exome-Sequenz der Tumorzellen in primären Fällen von Hodgkin-Lymphom zu sein. Unsere Studien zeigen,E-Durchführbarkeit von hochdurchsatzreichen, genomweiten Studien einzelner CHL-Fälle und haben bereits zur Identifizierung neuartiger genomischer Veränderungen mit dem Potenzial zur Erklärung von Aspekten der CHL-Pathogenese geführt.
Wir haben eine Pipeline weiterentwickelt, um die extrahierte DNA für genetische Untersuchungen mit hohem Durchsatz zu nutzen. Um zuverlässige Ergebnisse von bis zu 1.000 sortierten HRS-Zellen zu erzielen (das Minimum, das aus sequentiellen Fällen erhalten wurde), entwickelten wir ein modifiziertes DNA-Bibliotheks-Konstruktionsverfahren 8 der nächsten Generation, das es uns ermöglichte, die Adapter-Ligationseffizienz zu erhöhen und DNA-Fragment-Bibliotheken zu erzeugen Ohne übermäßige Verstärkung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von routinemäßigen klinischen Proben und den Nachweis von wiederkehrenden Mutationen und chromosomalen Veränderungen 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach der Beherrschung dieser Technik
Diese Arbeit ermöglicht die Exome-Sequenzierung aus Proben, die mindestens 10 ng DNA enthalten. Im klinischen Kontext schließt diese Grenze die meisten Feinnadel-Aspirationsproben aufgrund unzureichender Materialien aus, enthält aber adäquate Kernbiopsien und exzisionsbiopsische Proben. Dies ermöglicht die Erfassung von Daten aus einem größeren Satz von möglichen Samples.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Entwicklung dieser Projektmethode wurde von der Abteilung für Pathologie und Labormedizin von Weill Cornell Medical College finanziert. Wir bestätigen das Tri-Institutional Trainingsprogramm in Computational Biology and Medicine zur Teilfinanzierung. Wir danken den Wissenschaftlern, die ihre Zeit und ihr Wissen mit uns teilen, besonders Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Tschad Locklear; Und alle von der Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, einschließlich Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson und Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
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