Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
genica post-trascrizionale è regolato con precisione, cominciando con la trascrizione del DNA nel nucleo. Controllato da RNA vincolante proteine (RBPs), mRNA biogenesi e il metabolismo si verificano in particelle ribonucleoproteiche altamente dinamici (RNP), che associano e dissociano con un mRNA substrato precursore durante la progressione di RNA metabolismo 1-3. cambiamenti dinamici nella componenti RNP influenzano il destino post-trascrizionale di mRNA e di fornire la garanzia della qualità durante la lavorazione dei trascritti primari, i loro traffici nucleari e la localizzazione, la loro attività come modelli di mRNA per la traduzione, e l'eventuale fatturato di mRNA maturi.
Numerose proteine sono designati come RBPs in virtù dei loro domini ammino acido conservato, tra cui il motivo di riconoscimento RNA (RRM), l'RNA a doppio filamento dominio di legame (REA), e tratti di residui basici (ad esempio, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs sono di routineisolato da strategie di immunoprecipitazione e sono proiettati per identificare i loro RNA cognate. Alcuni RBPs co-regolare pre-mRNA che sono funzionalmente correlati, designati come regulons RNA 5-8. Questi RBPs, i loro mRNA cognate, e talvolta non codificante RNA, formano RNP catalitici che variano in composizione; loro unicità è dovuta a varie combinazioni di fattori associati, nonché al temporale sequenza, posizione, e la durata delle loro interazioni 9.
RNA immunoprecipitazione (RIP) è una tecnica potente per isolare RNP dalle cellule e per identificare le trascrizioni associati con analisi di sequenza 10-13. Passando da candidato a Genome-wide screening è possibile attraverso RIP combinato con un'analisi microarray 14 o high-throughput sequencing (RNA-Seq) 15. Analogamente, proteine co-precipitazione possono essere identificate mediante spettrometria di massa, se sono sufficientemente abbondanti e separabili dal anticorpi co-precipitazione 16,17. Qui, ci rivolgiamo la metodologia per isolare i componenti RNP di una specifica RNA affine da cellule umane in coltura, anche se l'approccio è alterabile per lisati solubili di cellule vegetali, funghi, virus e batteri. Analisi a valle del materiale comprendono l'identificazione candidato e validazione mediante immunoblot, spettrometria di massa, saggio enzimatico biochimico, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, come riassunto in Figura 1.
Dato il ruolo fondamentale della RNP nel controllare l'espressione genica a livello post-trascrizionale, alterazioni nell'espressione dei RBPs componenti o la loro accessibilità alle cognate RNA possono essere dannosi per la cellula e sono associati a diversi tipi di disturbi, malattie neurologiche 18. DHX9 / RNA elicasi A (RHA) è necessario per la traduzione di mRNA selezionati di origini cellulari e retrovirali 6. Questi RNA affini presentano strutturalmente affini elementi cis-agenti nel loro5 'UTR, che è designato come elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 19. Attività RHA-PCE è necessaria per la traduzione efficiente cap-dipendente di molti retrovirus, compreso l'HIV-1, e di geni regolatori crescita, tra Jund 6,20,21. Codificata da un gene essenziale (dhx9), RHA è essenziale per la proliferazione cellulare e la sua down-regolazione elimina la vitalità delle cellule 22. L'analisi molecolare di RHA-PCE RNP è un passo essenziale per comprendere il motivo per cui l'attività RHA-PCE è necessario controllare la proliferazione cellulare.
La caratterizzazione precisa dei componenti RNP RHA-PCE allo stato stazionario o su perturbazione fisiologica della cella richiede l'arricchimento selettivo e la cattura delle RNPs RHA-PCE in abbondanza sufficiente per l'analisi a valle. Qui, retrovirale PCEgag RNA è stato etichettato con 6 copie del cis-acting sito di legame RNA per la proteina di rivestimento MS2 (CP) all'interno della cornice di lettura aperta. La proteina di rivestimento MS2 è stato exogenously co-espresso con PCEgag RNA dal plasmide trasfezione per facilitare l'assemblaggio RNP in cellule in crescita. RNP contenenti la proteina di rivestimento MS2 con cognate MS2-tag PCEgag RNA sono stati immunoprecipitati dall'estratto cellulare e catturati su sfere magnetiche (Figura 2a). Per catturare selettivamente i componenti RNP legati alla PCE, l'RNP immobilizzato è stato incubato con un oligonucleotide complementare alle sequenze distali alla PCE, formando un ibrido RNA-DNA che è il substrato per l'attività RNasi H. Poiché PCE è posizionato in 'terminale 5' del 5 untranslated regione, l'oligonucleotide era complementare alle sequenze di RNA adiacenti al sito di inizio traduzione retrovirale (gag codone di inizio). RNase H scissione in prossimità della partenza gag codone rilasciato complesso UTR 5 'dalla RNP immobilizzata, che è stato raccolto come eluente. Successivamente, il campione è stato valutato mediante RT-PCR per confermare la cattura di PCEgag e SDS PAGE e immunoblotting per confermare la capture della proteina di rivestimento bersaglio MS2. Una convalida del legame RNA proteina PCE-associata, DHX9 / RNA elicasi A, è stata quindi eseguita.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'isolamento RNP e la strategia di identificazione RNA cognate qui descritto è un mezzo selettivo di indagare una specifica interazione RNA-proteine e di scoperta di proteine candidate co-regolamentazione di un RNP specifica nelle cellule.
Il vantaggio di utilizzare oligonucleotide-diretto RNase H scissione per isolare RNP è la capacità di catturare e analizzare il modo specifico cis-agendo elemento RNA RNP oltre RNP eterogenei legati a valle con l'elemento RNA cis-age…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il supporto dal NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
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