Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Post-transcriptionele genexpressie nauwkeurig geregeld, beginnend met DNA transcriptie in de kern. Gecontroleerd door RNA-bindende eiwitten (RBPs), mRNA biogenese en metabolisme optreden in hoogdynamische ribonucleoproteïnepartikels (RNP's), die associëren en dissociëren met een substraat precursor mRNA tijdens de progressie van RNA metabolisme ^1-3. Dynamische veranderingen in RNP componenten beïnvloeden de post-transcriptionele lot van een mRNA en zorgt voor kwaliteitsborging tijdens de bewerking van primaire transcripten hun nucleaire handel en lokalisatie, hun activiteit als mRNA sjablonen voor translatie en de uiteindelijke omzet van rijpe mRNA.

Talrijke proteïnen worden aangeduid als RBPs vanwege hun geconserveerde aminozuur domeinen, zoals de RNA herkenningsmotief (RRM), de dubbelstrengs RNA-bindende domein (RBD) en stukken van basische residuen (bijvoorbeeld arginine, lysine en glycine) ^4. RBPs zijn routinematiggeïsoleerd door immunoprecipitatie en strategieën worden gescreend om hun verwante RNAs identificeren. Sommige RBPs co-regulering pre-mRNA die functioneel gerelateerd, aangeduid als RNA regulonen ^5-8. Deze RBPs hun cognate mRNA en soms niet-coderende RNA vormen katalytische RNP dat in samenstelling variëren; hun uniciteit komt door verschillende combinaties van geassocieerde factoren, alsmede de chronologische volgorde, locatie, en de duur van hun interacties ^9.

RNA immunoprecipitatie (RIP) is een krachtige techniek om RNP's uit cellen te isoleren en geassocieerde transcripten middels sequentieanalyse ^10-13 identificeren. Verhuizen van kandidaat om genoombrede screening haalbaar is door middel van RIP in combinatie met een microarray-analyse ¹⁴ of high-throughput sequencing (RNAseq) ^15. Evenzo kan co precipiterende eiwitten worden geïdentificeerd door massaspectrometrie, of ze voldoende overvloedig en scheidbaar van de co-precipiterende antilichaam ^16,17. Hierbij gaan we in de methode voor het isoleren van RNP componenten van een specifieke verwante RNA uit gekweekte menselijke cellen, maar de benadering veranderbaar voor oplosbare lysaten van plantencellen, schimmels, virussen en bacteriën. Stroomafwaarts analyses van het materiaal zijn onder andere kandidaat identificatie en validatie door immunoblot, massaspectrometrie, biochemische enzymatische test, RT-qPCR, microarray en RNAseq, zoals samengevat in figuur 1.

Gezien de fundamentele rol van RNP's in het reguleren van genexpressie op post-transcriptioneel niveau, veranderingen in de expressie van component RBPs of de toegang voor verwante RNA's kunnen schadelijk voor de cellen en zijn geassocieerd met verschillende soorten aandoeningen, waaronder neurologische ziekten ^18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) nodig voor de vertaling van bepaalde mRNAs van cellulaire en retrovirale oorsprong ^6. Deze verwante RNA's vertonen structureel verwante cis-werkende elementen binnen hun5 'UTR, die wordt aangeduid als de post-transcriptionele controle element (PCE) ^19. RHA-PCE activiteit voor de doeltreffende cap-afhankelijke translatie van vele retrovirussen, zoals HIV-1, en groeiregulerende genen, waaronder JUND ^6,20,21. Gecodeerd door een essentieel gen (dhx9), RHA is essentieel voor celproliferatie en de neerwaartse regulatie elimineert cellevensvatbaarheid ^22. De moleculaire analyse van RHA-PCE RNP is een essentiële stap voor het begrijpen waarom RHA-PCE activiteit noodzakelijk om celproliferatie te regelen.

De precieze karakterisering van de RHA-PCE RNP componenten bij steady state of bij fysiologische verstoring van de cel vereist de selectieve verrijking en de vangst van de RHA-PCE RNP's in voldoende overvloed voor downstream-analyse. Hier PCEgag retroviraal RNA werd gelabeld met 6 kopieën van de cis-werkende RNA-bindingsplaats voor het MS2 manteleiwit (CP) in het open leesraam. De MS2 manteleiwit werd exogenously co-uitgedrukt PCEgag RNA door plasmide transfectie aan de RNP assemblage in groeiende cellen te vergemakkelijken. RNP die het MS2 manteleiwit met cognate MS2-tag PCEgag RNA werden immunogeprecipiteerd uit het celextract en vastgelegd op magnetische korrels (Fig 2a). Selectief vangen de RNP componenten gebonden aan de PCE, werd het geïmmobiliseerde RNP geïncubeerd met een oligonucleotide complementair aan sequenties distaal van de PCE, die een RNA-DNA-hybride dat het substraat voor RNase H activiteit. Aangezien PCE is gelegen in het 5 'uiteinde van de 5' onvertaalde gebied, het oligonucleotide complementair is aan het RNA-sequenties naast de retrovirale translatie startplaats (gag startcodon). RNase H klieving bij de gag startcodon bezit de 5 'UTR van het geïmmobiliseerde complex RNP, die was verkregen als elutiemiddel. Daarna werd het monster geëvalueerd door RT-PCR voor de daarbij PCEgag en door SDS PAGE en immunoblot bevestigt het captu bevestigenre van de doelgroep MS2 manteleiwit. Een validatie van de PCE-geassocieerde RNA bindend eiwit, DHX9 / RNA helicase A, werd vervolgens uitgevoerd.