の自動解析<em> C。エレガンス</emセレストソフトウェアを使用>スイム挙動

1.線虫の成長と取り扱い NGMを含む標準ペトリ皿上のC.エレガンスの成長は食料源1-3としてOP50-1 大腸菌でスポット。 所望の温度を維持するインキュベーターで培養液を保管してください。 C.エレガンスは、20°Cは、標準的な成長温度であると、15から25℃によく育ちます。 注：水泳は、しかし、活力が文化やスライドのプレートの汚れや過熱などの環境要因によって影響を受ける可能性が泳ぐ、堅牢な表現型です。安定した状態を維持するための強力な努力がなされるべきです。 単一の動物4の転送を処理するためにガラス棒に炎が封止された白金線で作られた自家製の線虫のピックを使用してください。 スイム分析のための設定2. 実体顕微鏡、デジタルCCDカメラ、およびデジタルビデオレコーディングソフトウェアからなる統合されたシステムを使用してください。セレストソフトウェアCAnは別のコンピュータ上で使用すること。 暗い布で顕微鏡を覆い、顕微鏡スライド上の水泳ドロップエリアにグレアを防止し、画像品質を向上させるために（ 例えば、フェルト）。 背景に動物の鋭いコントラストを得るために、完全な水泳領域のビュー、およびベースミラーに顕微鏡の作動距離と倍率を調整します。水泳解析ソフトウェアで計算可視化し、追跡のために非常にうまく機能黒い背景、に対して、白と大人の体を可視化するために暗視野に照明を設定します。 作業領域、顕微鏡スライドを維持し、非常にきれいドロップ泳ぐように注意してください。デブリは、大人の自由遊泳を閉塞することにより分析を妨害することができ、繊維の薄いスレッドが追跡中に​​動物を被申立として検出することができます。 液体中の体力の分析のための3動物の準備ピペット60μLoを1×M9バッファF顕微鏡スライド上にあらかじめ印刷10ミリメートルリングへ。ドロップが完全にリングの内側の領域をカバーしていることを確認します。ソフトウェアは、マルチウェルプレートを利用することになる場合よりも、スライドに含まれるこのドロップサイズを使用してより多くの水泳情報を抽出します。 単一の大人の線虫を選択し、液体を曇らせることができる細菌の輸送を最小限に抑え、1×M9バッファーの低下にそれらを転送します。最初にそれらを持ち上げ優しく、その後、多くの細菌叢が含まれていないプレートの側面への転送のために動物を配置し、それらをクロールさせること、およびによって細菌を最小限に抑えます。 ドロップに線虫を転送する場合は、動物25の動作に影響を与える可能性があり、水泳の時間の長さを短くする分析ステーションに近い解剖スコープを使用しています。 彼らはしばしば激しくクロスパスを移動する場合、ドロップだけ大人4名を配置します。 （コンピュータ解析を混乱させる）スイマーを重ねる最小化するためのガイダンスとして、配置することを検討してください彼らは古いと少ない活力を表示するとき、彼らは若く、健康なWTの大人とドロップあたり5匹の動物と同様に活性であるドロップ4匹。 注：健康なWTの線虫直感的液体中に配置された後、すぐに泳ぎ始め。彼らは凝集場合は、線虫のピックの助けを借りて、静かにドロップで大人を分離します。 液体中の体力の4分析 – 水泳のビデオ録画彼らの水泳を記録するために、顕微鏡のベース上の大人を搭載したスライドを置きます。液体中の個々の動物の行動の30秒のビデオキャプチャの詳細（ 動画1）、およびセレストソフトウェア8,26によって助けたときに容易に達成されるように多数のレコードのサンプリング。しかし、長い期間が他の特定の行動研究25のための理想的かもしれ泳ぎます。倍率差がaffecので重要なことは、すべての録画全体で同じ倍率を維持することを確認してくださいトンスイミング分析と意志バイアス比較。 注：これらの手順は、 材料の表に記載されているデジタルビデオ録画ソフトを使用してのガイダンスとして提供されています。私たちはこれをテストしていませんが、VirtualDubのオープンアクセス・ソフトウェアは、代用可能性があります。 696のx 520ピクセルの画像サイズ、0.02ミリメートル/ピクセルの画像解像度、および18フレーム/秒の速度：成功水泳分析のためのガイダンスとして、以下の設定を使用します。これらの設定のより高い解像度のバージョンでは、追跡を容易にすることができるが、プログラムによって計算された措置には影響しません。 注：顕微鏡スライド上の1×M9バッファー60μLの降下は上向きと下向きの水泳運動を最小化する多くの深さを、持っていませんが提供する水泳ゾーン。 [設定]で、[ディスク上の545フレーム」に設定し、「リミットシーケンスの大きさ ''を記録」にアクセスしてください。同じ見出しの下に、「利用レコーディングマネージャ]チェックボックスをオンにします。 「編集現在recorをクリックしてください鼎のスクリプトは…コマンド」ボタンを押すと、下の ''入力して、「停止条件」、および下の「グラブフレーム」を選択し「停止後の0：00：30.00」。 録音、自宅の見出しの下にある「RAMで新規シーケンス」を選択し、赤い「録音」ボタンを押してください。ソフトウェアは、デジタルカメラで30秒かけて545フレームを取得し、RAMメモリにそれらを保持します。 液体中の体力の5分析 – ビデオ処理ホームの見出しをクリックして選択することで、画像フレームのシーケンスにビデオを断片化」へのエクスポート全配列を… 'ビデオ録画ソフトウェアで。 注：デジタルビデオ録画ソフトウェアは、ここに提示水泳解析プログラムで読み取ることができますこれらの全ての.bmp、.jpgの、の.tif、.pngのいずれか、などのフレームを保存することができます。 .tifファイルはより多くのストレージスペースを使用することに注意してくださいが、そのような.jpgのようないくつかのフォーマットは、画質を劣化させる可能性があります。 MATLAB Bから水泳解析プログラムを起動しますyは、実行ボタンをクリックします。 水泳解析プログラムのホーム画面で、[追加1ビデオ」またはそのような遺伝子型、日付、試験と継続時間などの関連標識を結合しながら、画像フレームのシーケンスを一度にまたはグループ内の1つをアップロードするボタンの複数のビデオの追加」を使用します。ソフトウェアは、標識された配列のデータベースを作成します。 1 'をクリックすることで、アップロードしたシーケンス内の複数の動物の同時トラッキングを有効にします。プロセス・ビデオ」。新しい画面では、左のボックスに希望の動画を選択してクリックし、「リストに追加」。各ビデオについては、右下のビデオの最初の画像を表示するために右上のリストでその名前をクリックします。リングの内側に3ポイントを選択することで、水泳ゾーンを画定し、「上記に記載されているすべての動画プロセス」をクリックして処理を開始します。中央下部に処理の進行状況を表示します。 映像処理画面完了すると、「閉じます」。 6。液体中の体力の分析 – 測定 2」をクリックします。計算の措置は「検証したり、単一の動物の追跡を拒否するように、処理されたビデオは一度に1、アップロードすることができる新しい画面を開きます。処理されたビデオは、ビデオ名がその動画をアップロードするためにクリックすることができ、左側のリストに表示されます。 成功したトラッキング（緑ブロック）とは対照的に逃したトラッキング（赤ブロック）の分野に注力し、この手動手順を使用します。 注：ソフトウェアは、ロバストなトラッキングシステム（404ビデオ8から2020動物で観察されるように94.1パーセントの妥当性）を有しているので、別の方法として、1は有効な追跡の自動化された出力に依存することができます。 下半分の画面全体の最初のカラーバーの「セグメント化された身体の妥当性」を検索します。 「有効フレーム」の割合は緑色であり、かつ「拒否フレーム」の割合が赤です。有効なフレームの≥80％は、追跡私ことを意味するもの対策を計算するために使用nformationは30秒で540のうち少なくとも432フレームから来て18フレーム/秒で記録された裁判を泳ぎます。 簡単にナビゲートし、有効なのブロックを変更/ '次にブロック」、「スイッチの妥当性」、「分割ブロック」、および「アイソフレーム」オプションを利用したフレームを拒否しました。 2匹の動物が混雑していない水泳ゾーンでパスを越えていることをまれに、「スイッチ」ボタンで特定のフレーム範囲にわたって、その識別番号を切り替えます。 トラッキングと重複公演に関する追加情報については、画面の下半分に棒グラフを表示します。セグメント化された本体（フレーム当たりの動物の体の長さ）の長さは、重複発生率と相関します。 動画上の任意の明るいスポットが分析を妨害した場合、「グレアゾーン」機能を選択することで、水泳ゾーン内の明るい部分を調整します。 アップ前に妥当性入力を保存するには、「保存して計算措置」をクリック別の処理されたビデオをロードします。ソフトウェアは、計算し、この段階で、バックグラウンドで、個々の動物の水泳能力の曲率マップを（ユーザーに図示せず）とのパラメータを以下に示す（ ビデオ2）。 注：ここに焦点を当てて測定されたパラメータを表1に記載されています。ウェーブの開始速度、車体波数、非対称性、伸縮性、およびカールは、ソフトウェアは、動物のための計算曲率マップに基づいて計算されています。走行速度、ブラシストローク、およびアクティビティインデックスパラメータは、曲率マップに基づいていません。 「計算措置」画面を終了するには、「閉じる」をクリックします。 液体中の体力の7.分析 – 結果の出力注：ソフトウェアが容易に目で獲得していない非常に微妙にあからさまな行動特性からカバー水泳運動の複数のメジャー、上に報告することができます（ ビデオ3および4）。ここでウェーブ開始速度、ボディ波数、非対称、ストレッチ、カーリング、旅行速度、ブラシストローク、およびアクティビティインデックス：焦点は、典型的には、良好なダイナミックレンジを示す8つのパラメータです。 プログラムのホーム画面で、3 'をクリックしてください。表示結果は、「解析結果を得ることができます。 左側のボックス内のフレームの所望の分析配列を選択し、または「選択したサンプルに追加 ''新しいサンプルに追加]ボタンをクリックすることで、新規または既存のサンプルグループにそれらを移動することによって、統計的処理のためのサンプルグループを作成します。 画面の上部に選択することによってグラフや8各パラメータのサンプルの主要な統計情報を表示する第二の画面に移動するには、「これらのサンプルを表示：グラフ]をクリックします。 希望する場合は、「色」、「ヒストグラムの＃ '、およびセレクタ「ワームの＃'を使用して、画面の左上にあるバーグラフの表現を調整します。 つかいます「2Dヒストグラム」は、画面の左側にあるドロップダウンメニュー 'Y軸の測定」と「X軸上の措置'を介して任意の2つのパラメータの組み合わせをプロットします。終了し、「結果の表示」画面に戻るには、「閉じる」をクリックします。 開き、さらにスプレッドシートプログラムで操作するための.csvファイルとして詳細な数値データを保存するには、画面の左上にある「エクスポート…」ボタンを使用してください。 バックホーム画面に移動して、分析したビデオシーケンスを含むデータベースの保存を確実にするために「終了」をクリックする「閉じる」「結果の表示」画面が表示されます。