Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

T hücreleri bir işlevsel, serbest-dayanıklı T hücresi repertuarının ^1-3 üretimi sağlamak birçok kontrol noktaları karşılaşma, bu süre içinde timus gelişim ara bir dizi farklılık gösterir. Pozitif seçim kortikal timik epitelial hücreler (CTEC) ^-2,3 üzerindeki majör histokompatibilite kompleks molekülleri (MHC) tarafından sunulan, orta dereceli afınitede, peptide düşük, tanıyan T hücre reseptörleri (TCR) ile timositler hayatta kalmasını teşvik eder. Negatif seçim ve düzenleyici T (T _reg) hücre gelişimi MHC ^2,4 tarafından sunulan öz-peptid kuvvetle cevap timositlerin ortadan kaldırılması ya da saptırma yoluyla kendini tolerans kurulmasına katkıda bulunur. Olgunlaşmamış CD4 ⁺ CD8 ⁺ çift pozitif (DP) olgun T hücre alt içine seçim süreci geçmesi ayırt TCRler ifade timositleri, hangi MHC sınıf I kısıtlı CD8 ⁺ sitotoksik çoğunluğuveya MHC sınıf ikincil lenfoid organlara ^1-3 efektör işlevleri gerçekleştirmek için timus çıkmadan önce, CD4 ⁺ yardımcı tek pozitif (SP) T hücrelerini II kısıtlı.

T hücre gelişiminin karmaşıklığı ekleme dinamik göç ve stromal hücre ağının ^5-9 boyunca timositleri gelişen hücresel karşılaşır olduğunu. Bu stromal hücreler timosit gelişiminde belirgin rol oynayan ve farklı şekilde pozitif ve negatif seleksiyon ¹⁰ meydana timik kortikal ve medüller bölgeler arasında dağıtılır. Pozitif seçim öncelikle korteks yer alsa da, DP timositleri medulla göç ve medulla pozitif seçimi ve soy tamamlanması için gerekli ek sinyaller olabileceğini düşündürmektedir olgun T hücreleri içine ayırt önce TCR sinyallerini gerektirecek devam ettiğini biriken kanıtlar vardır farklılaşma ^11,12. Bundan başka,reaktif timositleri ^13,14 silinmesini kolaylaştırmak ifade uzman medüller timik epitelial hücreler (MTec) ve mevcut dokuya sınırlı antijenlerin varlığına rağmen, negatif seçim büyük bir kısmı her yerde bulunan bir kendinden peptit dendritik tarafından sunulan ifade yanıt olarak kortekste meydana hücreler ^15,16. Böylece, T hücre gelişiminin doğru modelleri timositlerde ve stromal hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırır ve bu hücreler pozitif ve negatif seçim tabi olarak timosit göç destekler sağlam kortikal ve medüller bölgeler ile, son derece organize timik mikro sağlamalıdır.

Ex vivo olarak tamamlamak için, yerinde, pozitif ve negatif seçim in vitro bir dizi okuyan bir araç olarak timositlerin analiz eder ve T hücresi gelişiminin in vivo modellerde ^17-22 geliştirilmiştir. Recapitulate etmek oldukça zor olmuşturPozitif in vitro seleksiyon, ama Notch ligandı ifade eden kök hücre popülasyonlarının veya stromal hücreler ile T hücre öncülerinin kokültürünün, özellikle OP9-DL1 / 4 hücreleri, in vitro modelde o paha biçilmez bir hale T soy bağlılığı ve sınırlı olumlu seçimi desteklemek için yeteneğine sahiptir çalışma T hücre gelişimi ^23-25. Bu sistemin Sınırlamalar Bununla birlikte, bu hücreler timik stromal hücrelerinde bulunan benzersiz peptid işleme makine ve üç boyutlu timik mikro yoksun olduğu gerçeğini içerir.

Daha teknik hantal, in vitro sistemler ile ilgili bazı engelleri aşmak yerinde ve timus seçim vivo modellerde rağmen. Reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) timositlerde ve timik stromal hücrelerin ^18,26,27 karışımlarını tarif içerir. Bu timik epitel hücre Reaggregates MHC sınıf I ve II ifadesini korumak ve developme destekleyebilirnt konvansiyonel T hücre alt, ama yine de kortikal ve medüller yapıları tanımlanmıştır yoksundur. Fetal timik organ kültürü (FTOC) lymphoreplete timik loplara lymphodepleted timik lob veya timositlerin enjeksiyon yoluyla asılı bırakma kültürü ile timositler ile tohumlandı ve CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T etkin gelişimini desteklemek edilebilir T hücresi gelişiminin popüler bir modeldir kültür ^18,28-31 zaman içinde hücre. Fetal timik lobların kültürünün başlangıcında mTECs bir yetersizlik var, ama tanımlanan kortikal ve medüller yapılar koşullara bağlı zamanla gelişebilir. Önemli bir husus, bu model, tercihan yetişkin T hücre gelişimi karşısında fetal destek olmasıdır. Son olarak, erişkin farelerde tanımlanan timik öncülerinin intrathymic enjeksiyonu teknik olarak zordur ama açıkça destekleyen bir ortam sağlar In vivo T hücresi gelişme. In situ ve in vivo modellerde Bu mükemmel araçlar t'nino çalışma T hücre gelişimi ve kullanımı bir deneme-by-deney temelinde ele alınmalıdır.

Timik dilimleri, ancak, son zamanlarda benzersiz, karmaşık ve genellikle daha yüksek verim denemeleri karşılamak için imkanı ile yerinde timik seçimi incelemek için çok yönlü, tamamlayıcı model olarak ortaya çıkmıştır. Timik dilim kortikal ve medüller bölgeler bütünlüğünü korumak ve geliştirme yanı sıra verimli pozitif ve negatif seleksiyon ^11,32-39 sırasında timosit göç destekler stromal hücrelerin bir çerçeve sunmaktadır. Timik dilimleri üstünde eklenen timosit alt kümeleri dokuya ve bunların uygun microenvironmental niş ^34,37 göç. üst üste timositleri konjenik işaretleri veya floresan etiketler ile timik dilim endojen hücrelerden ayırt edilebilir ve birkaç gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. Timik dilim Organotipik kültürler çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirdiğerleri arasında timus seçimi, timosit davranışı (göç ve hücresel etkileşimleri) ve timosit lokalizasyonu da dahil olmak üzere T hücresi gelişiminin. Fare başına ~ 20 timus dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, deney ölçeklenebilirlik timus seçimi yerinde modellerinde diğerinden daha genel olarak daha fazladır. timik dilim hazırlanması uzman gibi vibratome gibi ekipmanları, ve hücre ölümü aracılığıyla zamanla hücre kaybı ve bir kapsül zarının olmaması nedeniyle sınırlıdır kültürde timik dilim yaşam süresi gerektirmesine rağmen, timik dilimleri mükemmel bir model sağlamak olgun timik mikroçevresinin içinde timositlerin senkronize popülasyonlarının timus seçimi analizi için. Burada akım sitometri analizi için timik dilim, izolasyon ve timositlerin bindirilirken, ve ayrışma (timus, timus lobları agaroz gömme ve gömülü doku vibratome bölümlendirilmeleri hasat dahil) timik dilimleri hazırlanmasını tarif etmektedir.