ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

除草剤抵抗性^2を与える、様々な疾患^1を克服するために、トランスジェニック作物の設計上に配置された有意な刺激があった近年、バイオマス収率^7を高める、草食性^6を防ぐ、干ばつ^3,4および塩耐性^5を付与し、細胞壁の反抗を減少させます^8。この傾向は、CRISPRとTALENs ^9を用いて^、ゲノム編集、およびdsRNAの^10、miRNAの^11、およびsiRNA ¹²を介して遺伝子サイレンシングを含むトランスジェニック植物を生成するための新たな分子ツールの開発によって支援されています。これらの技術は、トランスジェニック植物の生成を簡略化しているが、彼らはまた、生成されたトランスジェニック植物の膨大な数は植物体再生に依存している従来のシステムを用いてスクリーニングすることができないボトルネックを作成しました。 、多くのサイレンシングゲノム編集構築物が急速に植物内に挿入することができるが、このボトルネックに関連します標的の形質は、植物を温室内で分析されるまで、頻繁に発見されていない所望の効果を生み出すことができません。この研究では、特異的ゲノム編集及び遺伝子サイレンシングの標的の多数の初期スクリーニングにおいて現在のボトルネックに対処するために、植物プロトプラストの迅速、自動化、ハイスループットスクリーニングのための方法を開発しました。

無傷の植物細胞とは対照的に、プロトプラストの使用は、自動化されたプラットフォームの開発のためのいくつかの利点を有します。まず、プロトプラストは、植物細胞壁の消化後に単離されており、もはや存在し、このバリアと、形質転換効率は^、13に増加します。無傷の植物細胞¹⁴およびアグロバクテリウム媒介形質転換¹⁵遺伝子銃形質転換のために2つだけの十分に確立された方法があります。微粒子銃がtransfoのための特殊な装置を必要とするこれらの方法のいずれもが簡単に、液体ハンドリングプラットフォームに変換することができますアグロバクテリウムを介した形質転換一方rmationは、共培養し、細菌のその後の除去を必要とします。どちらも高スループット方法のために適していません。プロトプラストの場合には、変換は、日常的にのみ、いくつかの溶液交換を必要とし、理想的には、液体ハンドリングプラットフォームに適しているポリエチレングリコール（PEG）媒介性トランスフェクション^16を用いて行われます。第二に、プロトプラストは、定義により、単一細胞培養物であり、従って、植物細胞培養物中で凝集し、鎖形成に関連する問題は、プロトプラストでは観察されません。プレートベースの分光光度計を用いて迅速なスクリーニングの観点から、複数の平面内の細胞、または細胞の凝集は、一貫した測定値を取得することの困難につながります。プロトプラストは、それらの培地よりも密であるので、それらは、プレートベースの分光光度法のために助長している単分子層を形成し、ウェルの底に沈降します。最後に、植物細胞懸濁培養物はprimarいる間ILYカルス¹⁷由来のプロトプラストは、組織特異的発現を同定する能力をもたらす、植物組織の数から採取することができます。例えば、遺伝子のルートで、または葉特異的発現を分析する能力は、表現型の予測にとって非常に重要であることができます。これらの理由から、本研究で開発されたプロトコルが広く使用されているタバコ（ タバコ L.）「明るい黄色'2（BY-2）懸濁培養物から単離したプロトプラストを用いて検証しました。

BY-2浮遊培養は、植物細胞¹⁸の分子分析におけるその遍在使用のために、高等植物の「HeLa細胞」細胞として記載されています。最近、BY-2細胞は、植物の効果を研究するために使用されている、細胞内タンパク質局在^23,24、および植物生物学において、これらの培養物の広範な有用性を示す基本的な細胞生物学^{25-27を 19-22を}ストレッサー。 BY-2培養物のさらなる利点は遺伝子発現研究²⁸向けに拡張再現性につながる可能性がアフィディコリン、と文化を同期する機能。さらに、方法は、伝統的に、プロトプラストを生成するために使用される酵素は、コスト高スループットシステムのために禁止されているように、低コストの酵素^29,30を用い^た BY-2プロトプラストの抽出のために開発されてきました。そのようなものとして、以下に記載されるプロトコルは、BY-2浮遊培養を用いて検証されていますが、それは任意の植物細胞懸濁培養に修正可能でなければなりません。概念実証実験は、ハードサンゴハマからオレンジ色蛍光タンパク質（OFP）レポーター遺伝子（pporRFP）はCaMV35Sプロモーターの制御下で^、31を ハマ使用して実行されます。