JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Küresel emülsiyon damlacıkların Temel Mitotik Mil Sulandırma

Published: August 13, 2016
doi:
10.3791/54278
, , ,
1Department of Bionanoscience,Delft University of Technology

Summary

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Abstract

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Introduction

mitoz sırasında, çoğaltılan genom kromozomları yeni kurulan kızı hücreleri üzerinde kardeş kromozomlardalerde eşit dağılımını sağlamak için hücre ekvatorda düzenlenmektedir. Kromozom konumlandırma ve segregasyon iki karşıt sentrozom kaynaklanan mili mikrotübül onların eki aracılık eder. Sadık kromozom dağılımı sağlamanın yanı sıra, mitotik iğ yönü de hücre bölünmesi uçağı 1 belirler. Hücre bölünmesinin koordine yönlendirme gelişimi birçok aşamaları sırasında ve doku homeostazında 2 için gereklidir. Özellikle, düzenlenen mitotik iğ konumlandırma hücresel içeriği asimetrik dağılımı neden olabilir, hatta farklı boyutlarda 2 kızı hücrelerini üretirler. Mitotik iğ montaj ve oryantasyon profaz başlar ve işbirliği ve kuvvet-jeneratörler 3,4 karşısına arasındaki karmaşık bir etkileşim tarafından orkestra edildiği. kuvvetlerin b oluşuroth çekme ve itme kuvvetleri. Bu kuvvetler, hücre korteks ile iş mili kontaklar olarak silindirin içinde hem de üretildiği ve mikrotübül dinamiklerine göre yanı sıra moleküler motorlar ve çapraz bağlayıcıların (Şekil 1) tarafından oluşturulmuş olabilir.

mikrotübülüsler hücre korteks gibi sert yapılara karşı büyüyünce Pushing kuvvetleri oluşturulabilir. Sistem içinde üretilen toplam direnç kuvveti bağlı olarak, bu mitotik iğ (düşük güçler) yeniden konumlandırılması ile sonuçlanabilir veya mikrotübül burkulma veya felaket (yüksek kuvvetler) 5-8 tetikleyebilir. Uzunluğu 9 mikrotübül burkulma güçlü bir belirleyici olduğu iterek oluşturulabilir kuvvetin miktarı, mikrotübül uzunluğuna bağlıdır. Buna ek olarak, tek bir sentrozom kaynaklanan mikrotübüller diğer sentrozom karşı erken profaz 3,10 içinde sentrozom ayırmanın gerçekleştirilmesi için öne sürülmüştür bir mekanizma itebilir.

Reklamdabüyüyen mikrotübül tarafından oluşturulan kuvvetleri itme, mikrotübül temas biter hücre korteksine koşul da güçleri 11 çekerek arabuluculuk yapabilirsiniz. Birden laboratuvarların Çalışmalar kortikal kuvvet jeneratör kontrollü aktivite vivo 1 mitotik iğ asimetrik konumlandırma için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu çekme kuvveti için gerekli (bundan böyle 'dinein "olarak adlandırılır) korteks lokalize sitoplazmik dinein, eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motor proteinlerinden 8,12,13 olup. Örneğin, maya, korteks 14 boyunca kayar motora bağlı mikrotübül mikrotübül kafes sonucu kortikal dinein yanal etkileşimleri tomurcuklanmasına. Ancak, kortikal çekme kuvvetleri de Mikrotübülleri 8 depolimerizasyon için son ekleri oluşturmak için dinein yeteneği ile oluşturulabilir. Mikrotübül büzülme tarafından üretilen enerji genellikle daha yüksek büyüklükte bir sipariş kuvvetler yol açabilir (~ 50 pN (15 referans </syukarı>)) bireysel motorlu proteinler tarafından oluşturulan kuvvetler daha (~ 7-8 pN (ref. 16)). Depolimerizasyon mikrotübül kortikal dinein sonu-on eki tomurcuklanan maya 17 ve C mili konumlandırma teşvik elegans 13. Motor bağımlı kayma ve mikrotübül depolimerizasyon tahrik hem kortikal çekme kuvvetleri işbirliği ya da in vivo birbirini dışlayan olup olmadığını mevcut bilinmeyen yer almaktadır.

mikrotübül itme kuvvetleri ve dinein aracılı kortikal çekme kuvveti ek olarak, sentrozom konumlandırma çok sayıda başka proteinlerle mitotik iğ içinden kontrol edilir. Kinesin-5 motorlar, örneğin, dışarı doğru kayar kuvvetleri 18-20 üretimi ile sonuçlanan, antiparalel interpolar mikrotübülleri bağlantı çapraz tetramerler olarak mevcuttur. Kinesin-5 Motor ailesinin üyeleri C haricinde, incelenen tüm ökaryotlarda sentrozom ayırma ve çift kutuplu spiralin montaj için gerekli olan elegans (referans 21 gözden).

Ayrıca, ASE1 / PRC1 ailesinin yayılabilir çapraz bağlayıcılar de in vivo ve in vitro 22-27 interpolar mikrotübül mikrotübül bölgelerinin üst üste lokalize edilmesi için bilinmektedir. Örtüşen mikrotübül bölgenin ASE1 odaklı genleşme kuvvetlerin vitro 28,29 bölgesindeki kinesin-14 aracılı sürme kuvvetleri dengelemek için yeterince büyüktür. Hücrelerde, ASE1 / PRC1, mil orta sonda 25-27,30 mikrotübül bölgeleri üst üste yayılabilir çapraz bağlayıcılar tarafından oluşturulan kuvvetleri önemli derecede mili düzenlenmesine katkıda düşündüren kararlı oluşumu için gereklidir. Son olarak, mitoz kromatin gelen kuvvetler ve kinetokorlar çeşitli yollar 3 ile mitotik iğ montaj ve konumlandırma etkilemektedir. Bu bileşenler Burada tarif edilen sulandırma deneyleri parçası olmadığından, bunlar ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır.

jove_content "> Farklı teoriler yukarıda açıklanan farklı moleküler bileşenleri ve kuvvetler iğ montaj ve konumlandırma işbirliği nasıl var, ancak biz niceliksel bir anlayış hala uzağız. Buna ek olarak deneylere canlı hücrelerde, saflaştırılmış bileşenler ile in vitro deneyler güçlü sağlamak rota Bu hedefe ulaşmak için. Burada, temel iğ su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları içinde yeniden edildiği en son yayınlanan yöntemlerin adapte edilmiş ve genişletilmiş versiyonu (Roth et al. 31), bir görsel bir kılavuz mevcut bulunduklarında, bir ile başlayan mikroakışkan teknikler kullanılarak bileşenleri minimum sayısıdır., küresel damlacıklar mitotik hücre karşılaştırılabilir boyutlarda oluşturulacak. bu damlacıklar içinde, saflaştırılmış sentrozom ve tübülin, mikrotübül aster dinamikleri üzerinde çalışmak üretimi ve aster-aster etkileşimleri zorlamak için birleştirilebilir. tarafından kortikal (örneğin dinein gibi) ve inter-polar (örneğin kinesin-5 / ASE1) kuvvet jeneratörler tanıtan, bizin vivo durumu benzemeye başlar giderek karmaşık mili benzeri yapılar sulandırmak.

Protocol

Mikroakiskan Chips 1. Hazırlık Not: mili tertibatının aşağıdan yukarı çalışma için, küresel bir su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları kullanılır. Bu fosfolipidler ve yüzey aktif madde, bir tek tabaka çevreleyen yağ fazından ayrılmış, sulu mikro damlacıklar vardır. Bu emülsiyon damlacıkları mikroakışkan polidimetilsiloksan (PDMS) fiş üretilir. Kanal geometriler ve akış oranlarındaki değişiklikler ayar damlacık boyutu için kullanılabilir. Burada tarif edilen mikroakışkan tasarımda, damlacıklar, bir memeli mitotik hücre geometrik tutulmasını taklit etmek için, yaklaşık 15 um bir çapa sahip olarak oluşturulur. Photomask Tasarım ve Kalıp İmalat Üç giriş kanalı 31 içeren bir photomask tasarlayın. Giriş kanalı 1 damlacık içeriğini (bkz bölüm 3 "temel mikrotübül asters yeniden kurgulamak") içeren su fazı, bağlanır. Giriş kanalı 2 yağ fazı (bkz 2.1 "Lipid / yağ fazlı bağlanırse hazırlık "). gözlem (isteğe bağlı) (Şekil 2a-b önce ek lipit / yağ-faz ile emülsiyon damlacıkları sulandırmak için giriş kanalı 3 kullanın). NOT: Tüm giriş kanalları tuzak toz, PDMS parçacıklar ve (protein) agrega bir toz filtresi (2 mikron kanalların bir labirent) tarafından takip edilmektedir ve mikroakışkan kanallar (Şekil 2d) bloke önlemek için. Kanallar 75 mikron genişliğinde ve emülsiyon damlacıkları (Şekil 2c) oluşturan bir 12.5 mm genişliğinde kavşakta lipit / yağ fazı ve su fazı karşılar. negatif kutupları (photomask şeffaf tasarlanmış yapıları ile karanlık olacak), Sipariş ve film substrat üzerine basılan fotoğraf maskeleri edinin. kalıp İmalat Bir temiz oda ortamında (1.800 rpm, 45 saniye ardından 500 rpm, 10 sn) bir spin-kaplayıcı kullanılarak 4 inç silikon yonga üzerine spin-kaplama SU-8 3025 fotorezist ile kalıpları Üretiyor. SU-8 kaplı Açığaphotomask yoluyla silikon gofret. 40 mikron kalınlığında ~ kanallarını oluşturmak için üreticinin talimatlarına göre gofret geliştirin. mikroakışkan çip yapma plastik bir spatula kullanılarak bir tekne benzeri bir kap içinde 1 kısım sertleştirici (toplam ~ 40 gr) ile 10 parça PDMS nin önceden polimer karıştırın. ~ 30 dakika boyunca bir vakum odasına tekne benzeri kap ihtiva eden bir yer PDMS. Hava kabarcıklarını çıkarmak için. ~ 1 cm kenarları dik duran bir bardak oluşturmak için kalıp etrafında alüminyum folyo sarın. PDMS dökün (~ toplam hacminin% 75) kalıp içinde, bir başka ~ 30 dakika boyunca bir vakum odası içinde bırakın. (Hava kabarcıklarını çıkarmak için) ve bir fırın içinde 100 ° C'de 1 saat boyunca tedavi. Spin-kat 100 ° C'de 1 saat boyunca kür ardından cam slaytlar üzerine geri kalan PDMS (4000 rpm'de 30 saniye, ardından 200 rpm'de 5 saniye). Basınçlı hava / N 2 Akışlı, ön temizliği gerekli değildir kullanarak cam slaytlar tozu temizleyin. NOT: PDMS kaplı cam slaytlar mikrofon hem de kullanılabilirrofluidic çip ve akış hücresi üretimi (ayrıca 2.2 bakınız). Yavaşça bir jilet kullanarak kalıp kapalı PDMS şerit ve yumruk delikleri (girişler için 0.5 mm, çıkış için 0.75 mm) mikroakışkan çip ve birkaç saniye için bir laboratuvar korona yüzey işlemcinize kullanarak PDMS kaplı cam slayt .Corona-tedavi . (Kanal aşağı bakacak şekilde) cam slayt üzerine mikroakışkan çip yerleştirin ve o cips fırında / n 100 ° C'de (Şekil 3a). tozsuz bir ortamda aylarca mikroakışkan cips saklayın. 2. Mikroakışkan Kur Not: Emülsiyon damlacıkları, bir mikroflüidik setup ve yukarıda tarif edilen mikroakışkan fiş kullanılarak oluşturulur-içinde-su yağ. lipit / yağ-fazı bileşimi deney koşullarına bağlı olarak değişebilir. Yağ çözünür hale lipidler içinde su bakan kendi polar baş grupları ile su-yağ arayüzünde bir tek tabaka oluşturacak. proteinleri hedeflemek içinDamlacık sınırına (örneğin, dinein), biyotinil-fosfatidiletanolamin düşük miktarları (biyotinil-PE) lipidler ilave edilebilir. Bu biyotinile dinein işe alınması streptavidin aracılı multimerizasyon yoluyla (bölüm 4.1 "Dinein damlacık korteks hedefleyen" bölümüne bakınız) izin verir. Damlacıklar bir yüzey aktif madde ilave edilerek stabilize edilmiş PDMS kaplanmış akış birimlerinde depolanır. Lipid / yağ fazı hazırlama Karıştırın kloroform-çözülmüş 1,2-dioleoil-sn-bir 4-glisero-3-fosfo-L-serin (DOPS) ve biyotinil-PE lipidler Cam pipetleri kullanılarak bir cam tüp içinde 1 mol oranında (kullanım öncesi kloroform ile pipetleri yıkayın ) kullanın. 0.5 mg / ml aralığında bir yağ konsantrasyonu ile sonuçlanan, ~ 250 ug bir lipit toplam hazırlayın. Dikkatle N2 akımı ile ve daha sonra ~ 1 saat boyunca bir vakum odasına lipid karışımının kurutulması. 0.5 mg / ml (yaklaşık 500 ul olmak) için, mineral yağ ve% 2.5 yüzey aktif madde içinde kurutulmuştur lipidleri çözülür. Bir lipid / yağ örnek yerleştirinultrasonik banyo ve 30 dakika boyunca sonikasyon. 40 kHz tamamen lipitleri çözmek için. Akış hücresi hazırlanması Spin-kaplama PDMS kapak camı üzerine (4000 rpm'de 30 saniye, ardından 200 rpm'de 5 saniye) (Bölüm 1.3) ve cam slaytlar homojen katmanın için (30 saniye 1500 devir ve ardından, 100 rpm'de 5 saniye) PDMS. NOT: En iyi görüntü kalitesi için, mikroskop amacı ile eşleşen bir kalınlığa sahip kapak gözlük kullandığınızdan emin olun. 1.5 (~ 0.17 mm): Bu durumda. bir fırın içinde 100 ° C'de 1 saat boyunca PDMS kaplı kapak gözlük ve cam slaytlar Cure. yakından aralığı ile akış hücreleri olun (~ 2 mm) laboratuvar sızdırmazlık filmin ince dilim (~ genişliğinde 3 mm) PDMS kaplı cam slaytlar üzerine. tozsuz bir ortamda saklandığında, kullanılmayan kanallar diğer zamanlarda kullanılabilir. laboratuvar sızdırmazlık filmi ~ 1 dk eriterek bir PDMS kaplı lamel ve mühür ile akış hücreleri örtün. 100 ° C 'de, presyumuşak (Şekil 3c). Valap (Şekil 3c) ile laboratuvar sızdırmazlık filmi -Cam-sınırları kapatın. Mağaza akış hücreleri tozsuz bir ortamda aylarca. PDMS Kupası Hazırlık Uzun süreli görüntüleme için, (~ 3 mm kalınlığında) PDMS bir dilim 4 mm çapında bir delik açılarak bir PDMS fincan PDMS dilim ve bir PDMS kaplı cam kapak Corona-tedavi ve birbirlerinin üstüne koyun. / N (100 ° C'de) (Şekil 5A) n PDMS fincan pişirin. Emülsiyon-damlacık oluşumu ters parlak alan mikroskobu üzerinde damlacık oluşumunu izleyin. PEEK tüpler kullanarak mikroakışkan çip basınç kontrolörü bağlayın (çapları: 510 mikron (dış) ve 125 mikron (iç)) (Şekil 3a). Tamamen giriş 2 lipid / yağ faz ile mikroakışkan cips doldurun. MRB80 bazlı suda faz tanıtılması (bölüm 3 "yeniden kurgulamak bazik mikrotübül asters bkz4; değiştirilmesi) lipit / yağ fazı ve su fazı basınçla giriş 1. Kontrol damlacık boyutundan ~ çapı 15 um (Şekil 3b) damlacıklar oluşturmak için kullanılır. Not: Bu ayar kullanılarak, arzulanan boyutta damlacıklar oluşturmak için suda faz lipit / Yağ fazında ve ~ 200 mbar için ~ 800 mbar kullanımı. İstenen damlacık boyutu ve gerekli miktarda elde edildikten sonra (~ numune başına 10 ul), (tam akış hücresi dolgu) akış hücresi içine çıkış kanalı ve yükten damlacıkları toplanır. dikkatle valap kullanılarak akış hücresi uçlarını kapatın (tam olarak kapalı akış hücreleri görüntü onlara güçleştirir, damlacıkların geniş hareketine neden olabilir). Buna ek olarak, damlacık hareketi sonuçlanır hava kabarcığı oluşmasını engeller. örnek çapraz bulaşmayı ve tıkanmayı önlemek için kullanımdan önce ve sonra izopropanol ile yoğun PEEK tüpleri durulayın. 3. sulandırma Temel Mikrotubul Asters Not: Deney gereksinimlerine bağlı olarak damlacık içeriği değişebilir. Tüm tamponlar MRB80 tabanlı (80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2 (pH 6.8)) olan ve tüm numuneler buz üzerinde hazırlanır. Genel olarak, damlalar sürekli sentrozom, mikrotübül polimerizasyon, bir oksijen temizleyici sistemi ve blokaj ajanı için gereken bileşenleri ihtiva (bölüm 3.1). istenirse mikrotübül kuvvet jeneratörler ve gerekli kofaktör ve hedefleme faktörleri dahil edilebilir (bölümler 4.1 ve 4.2). Emülsiyon damlacıkları içinde aster formasyonu için genel kurulumu (Şekil 3d) -80 ° C'de, küçük parçalar halinde önceden ve mağaza glikoz oksidaz (200 mM DTT ve 10 mg / ml katalaz içinde 20 mg / ml glikoz oksidaz) karışımı hazırlayın. Κ-kazein, sığır serum albümin (BSA) içeren bir 'engelleme karışım' hazırlayın, Tween-20 ve (nötr belirteç olarak) floresan dekstran küçük aliquo önceden ve mağaza (bakınız Tablo 1)-80 ° C'de TH. tekrarlanan donma-çözülme döngüleri önlemek. Emin olun tüm bileşenleri taze hazırlanır. Küçük parçalar halinde -150 ° C'de Moudjou ve ark., 32 ve mağaza tarafından tarif edildiği gibi, insan lenfoblastik KE37 hücre çizgilerinden sentrozom saflaştınlır. Oda sıcaklığında sentrozom çözülme ve 20 dakika ~ 37 ° C'de inkübe edin. Kullanmadan önce uygun mikrotübül çekirdeklenme sağlamak. NOT: Bu deneme sırasında mikrotübül çekirdeklenme teşvik etmektedir. Bu süre içinde, tubulin (floresan ve "koyu renkli"), guanozin trifosfat (GTP), bir oksijen tutucu sistem ihtiva eden, "deney karışımı 'hazırlanması (glükoz, glükoz oksidaz, katalaz ve 1,4-ditiyotreitol (DTT)), moleküler güç jeneratörleri (örneğin mikrotübül motorlar / çapraz bağlayıcılar), adenosin trifosfat (ATP) ve bir ATP-yenileyici sistemi (fosfoenolpiruvat (PEP), piruvat kinaz (PK) ve laktat dehidrojenaz (LDH)) buz üzerinde (bakınız Tablo 2). Önceden serinbuz üzerinde Airfuge rotor. Soğutulan Airfuge rotor (3 dakika için 30 psi) .Add önceden ısıtılmış sentrozom (1-2 sentrozom içeren damlacıklar için amaç sentrozom miktarını optimize) numune dönerler. Bölüm 2.3'te tarif edilen yöntemler kullanılarak bir emülsiyon damlacıkları üretmek için bir araya karışımı kullanın. Bileşen stok konsantrasyonu Nihai konsantrasyon (tahlilinde) hacim Yorum Yap Dekstran-647nm 75 uM 3.75 uM (0.6 uM) 5 ul κ-kazein 20 mg / ml 12.5 mg / ml (2 mg / ml) 62.5 ul Tween-20 % 5 % 0.375 (0.06%) </td> 7.5 ul BSA 200 mg / ml 12 mg / ml (1.9 mg / ml) 6 ul MRB80 19 ul 100 ul son 2 ul alikotları mağazası Tablo 1 'Engelleme karışımı' ve bileşenleri bloke karışımı bileşenleri, su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları içinde aks-benzeri yapıların yeniden oluşturulması için gereklidir.. açıklaması için, "temel mikrotübül asters yeniden kurgulamak" ana metin bölümüne 3'e bakınız. Malzemeler ile ilgili detaylar için, "Malzeme Tablosu bkz. Bileşen Stok concentration nihai konsantrasyon hacim Yorum Yap engelleme karışımı 1.6 ul tubulin 500 uM 30 uM 0.6 ul Tübülin-488/561 50 uM 3 uM 0.6 ul GTP 50 mM 5 mM 1.0 ul Dynein-TMR 178 nM 30 nM 1.7 ul streptavidin 5 mg / ml 200 nM 0.4 ul kortikal dynein sadece Kinesin-5 1.6 mM 80 nM 0.5 ul ATP 25 mM 1 mM 0.4 ul motorlarda sadece PEP 0.5 M 25.6 mM 0.5 ul motorlarda sadece PK / LDH 800 U / 1,100 U 23 U / 32 U 0.3 ul motorlarda sadece ASE1-GFP 400 nM 80 nM 2.0 ul glikoz 2.5 M 50 mM 0.3 ul Son adım Glukoz oksidaz 50x 1.0x 0.3 ul Son adım MRB80 x 9 ul son Tablo 2: 'Testi Mix' bileşenleri. </strong> Bir su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıkları içinde aks-benzeri yapıların yeniden oluşturulması için gerekli deney karışımı, bileşenleri. açıklaması için, "temel mikrotübül asters yeniden kurgulamak" ana metin bölümüne 3'e bakınız. Malzemeler ile ilgili ayrıntılar için, Malzeme Tablosu bkz. 4. Tanıtımı Mili Meclisi faktörleri Not: Burada tarif edilen deneylerde, yeşil flüoresan proteini (GFP) S. kesilmiş versiyonunu etiketli cerevisiae dinein yapay 33 Etiketleme-amino-terminal glutation S-transferaz (GST) ile dimerize olduğu kullanılmıştır. Bu protein, proteinin iki kopya bir IgG bağlama alanı içeren bir afinite etiketi üzerinden saflaştırılır. Burada kullanılan varyant karboksi-terminal ve N-terminal SNAP-etiketi saflaştırılmış proteinler biotinylate için kullanılan üzerine tetrametilrodamin (TMR) etiket ile etiketlenir. Yapı Ayrıntılar için Roth ve ark bakın 31.; arıtma ayrıntılar için, Rec bakınızk-Peterson ve ark. 33. GFP-biyotin-dinein-TMR dinein için biyotinil-PE lipitler (Şekil 3e) bağlantı biyotin-streptavidin kompleksi oluşması aracılığıyla damla kortekse hedeflenebilir. Dynein Damlacık cortex Hedefleme 'Tahlil karışımı' GFP-biyotin-dinein-TMR dahil 30 nM'lik bir son damla konsantrasyonda (bakınız Tablo 2). 'Tahlil karışımı' olarak streptavidin Dahil 200 nM nihai damla konsantrasyonda (bakınız Tablo 2). Not: Dinein mikrotübüller üzerindeki adım adım hareket ATP hidroliz bağlıdır. Bu nedenle, ATP ve 'tahlil karışımı' içerisine (PEP ve PK / LDH ihtiva eden) bir ATP yenileyici sistemi, (bakınız Tablo 2). NOT: Rekombinant tam uzunlukta S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) nazikçe Diez laboratuarında (Moleküler Biyomühendislik, Technische Universitat Dresden, Dresden, Almanya için Merkezi) tarafından sağlandı, bkz. Rekombinant tam length histidin-etiketli S. pombe GFP-ASE1 nazik Jansons laboratuar (Wageningen Üniversitesi, Wageningen, Hollanda) temin edilmiş ve 80 nM'de konsantrasyonlarda 'tahlil karışımı' ilave edildi. 5. Görüntüleme Not: Deney sırasında, mikrotübül büyüme sıcaklığının değiştirilmesi ile kontrol edilebilir. görüntüleme koşulları seçerken, ticaret-off, yüksek kaliteli görüntüleme ve uzun zaman dönemleri için mili takımını izlemek için yeteneği arasında yapılması gerekir. Farklı koşullar altında mili formasyonunun kinetiği karşılaştırmak için, farklı içeriklere sahip damlacıklar karıştırılır ve aynı akış kanalında görüntülenmiştir edilebilir. Temel Görüntüleme Ayarları kapalı bölme ile bir sıcaklık kontrollü bir ortamda görüntüsü. ~ 30 dakika 26 ° C sonra bireysel mikrotübül gözünüzde canlandırın. görüntüleme birlikte, 30 ° C kadar sıcaklığının artırılması ile mikrotübül büyümesini teşvik. NOT: syarlar aşağıda mikroskop kurulum özgüdür ve farklı sistemler ve farklı işletim yazılımı ile değişebilir. Burada açıklanan tahliller Tüm dönen bir disk konfokal kafa ile bir motorlu ters sistemde görüntülü ve Andor iQ 3.1 gibi görüntüleme yazılımı kullanılarak çalıştırılır. Bir 100X yağ batırma objektifi ve EMCCD kamera ile tüm görüntüleri elde edebilir. Set uyarma lazerler 488, 561 ve kabaca ~% 10 yoğunluğu 641 nm. 'Satın alma' paneline gidin% 10 'AOTF' sekmesi ve slayt lazer şiddetleri tıklayın. ayarları kaydetmek için 'kayıt' üzerine tıklayın. Z -projections için 1 mikron aralıklarla (~ 20 images / damlacık) ile yığınlar alır. 'Panelde tık' ana "kamera git düzenleme z 've set' Z adım '1.0. Üzerine tıklayın' ayarları saklamak için 'yanında yer almaktadır. 'Satın alma' panelinde 'kamera' sekmesini tıklayarak maksimum doğrusal EM-kazanç ayarlama ve 300 Set maruz EM kazanç çubuğunu kaydırınAynı sekmede 200 milisaniye kez. ayarları kaydetmek için 'kayıt' üzerine tıklayın. Canlı Görüntüleme Canlı görüntüleme için kullanarak yazılım kontrolleri z -projections her 2 dk olun. ~ 100 ms maruz kalma sürelerini azaltarak 1-2 saat süresince. (5.1.3 tarif edildiği gibi) (aynı 5.1.4 tarif edilmiştir), 2 um Z -intervals artar. 'Tekrar t' tıklayın ve 2 dakika ayarlanır, ana 'kamera' panelinde zaman serisini ayarlayın. 120 dakika toplam süre aralıkları. canlı analizleri için, damlalar olabildiğince hareketsiz olduğundan emin olmak için, bir PDMS fincan yerine düzenli bir akış-hücre kullanımı. 2 Koşulların Kombine Görüntüleme mikroakışkanları kullanarak damlacıkları üretin ve buz üzerinde bir PDMS kaplı cam slayt üstüne saklayın. damlacıkların ikinci seti oluşana dek Bu mikrotübül çekirdeklenme önler. damlacıkların ikinci set üretiminde önce, PEEK tüpleri ile mikroakışkan çip durulayınMRB80 ve tamamen lipit / yağ faz ile mikroakışkan çip doldurun. ile ve farklı renkleri ile damlacıklar ayırt etmek için floresan dekstran (veya farklı dalga boyu fluorophores kullanarak dekstran) olmadan damlacıkları oluşturmak. damlacıkların ikinci parti üreten sonra, yavaşça pipetleme ile damlacıkları karıştırın ve tek bir akış hücresi / PDMS-kap içine yerleştirin. Görüntü Analizi. Fiji (açık kaynak yazılım online) 34 kullanarak görüntüleri analiz edin. 'Hyperstack yığını' – 'hyperstacks' – canlı deneyleri için, 'resim' kullanarak hyperstacks içine yığınları dönüştürmek. z-dilimleri ve zaman dilimlerinde doğru sayısını ayarlayın. 'Yığınlarını' – – 'z-proje' 'resim', z-projeksiyonları yapmak seçmek için. 'Maksimum yoğunluğu' projeksiyonu seçin. 3D-rekonstrüksiyon için, ilk olarak 'resim' git – 'özellikleri' ve piksel heigth, voksel derinliği ve fr ile doğru piksel setame aralıkları. 'Tamam' ı tıklatın. 'Yığınlarının' – – '3D projesi', 'enterpolasyon' kutusunu işaretleyin ve 'Tamam' düğmesine tıklayın 'resim' seçin.

Representative Results

Önceki bölümlerde sunulan yöntemler su-içinde-yağ emülsiyonu damlacıklarının geometrik tutulmasını kullanılarak karmaşıklığı arttıkça aks-benzeri yapıların tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu bölümde niteliksel bu tahlillerin yeteneği gösteren temsili sonuçlarını açıklar. Bir çift kutuplu spiralin monte edildiğinde, mitoz sırasında, hücreler insan hücreleri için ölçülen yaklaşık 15 um bir çapı olan küreler oluşturmak için yuvarlak. Bu özellik mitotik hücre şekil kısıtlar hem iğ boyutunu ve yönlendirmesini 35,36 yönlendiren bir geometrik sınır sağlar. Mikroakışkan teknikleri, doğru canlı hücrelerde gözlenen durumun benzer ve bu nedenle in vitro mitotik iğ aşağıdan yukarıya yeniden izin geometrik hapsi düzeyi sağlamak. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-mikrotübül büyümesi geometrik sınırlarla kısıtlı olduğunda sayfa = "1"> Mikrotubul asters zaten kendileri tarafından karmaşık davranış yeteneğine sahiptirler. mikrotübül büyüdükçe, yeni, tubulin dimerlerinden eklenmesi ile oluşturulan itme kuvvetleri emülsiyon damlacıklarının yanları iki sentrozom sürücü. İlk başta, sentrozomlar serbestçe sınırlı hacim (Şekil 4a, sol panel) içinde yaygın. yaklaşık 20-30 dakika sonra, ilk mikrotübül mikrotübül her yöne korteks karşı büyüdükçe görünür ve sentrozom difüzyon sınırlı olur olur. ara madde uzunlukta (damlacık çapının yaklaşık% 50) mikrotubul Asters (sterik) ve diğer sentrozom korteks birbirlerine karşı itme mikrotübüller ile birlikte, her biri başka bir dağılmasına neden olabilir. Bu birbirine (Şekil 4a, orta panel) karşıt iki sentrozom tipik bir 'bipolar' iğ gibi düzenleme ile sonuçlanır. mikrotübül damlacık-dia ~% 50 daha uzun büyüyüncemetre, sentrozomlar damlacık korteks (Şekil 4a, sağ panel) boyunca büyüyen mikrotübül ile damlacık karşıt sınırları daha da itti olsun. Deneylerde mikrotübül büyüme oranları, sıcaklık ve tübülin konsantrasyonlarında hem çok hassas olduğunu not etmek önemlidir. çekirdeklenme ilk gözlendiğinde ve kararlı durum aster pozisyonları ulaşıldığında Bu parametreler, bu nedenle güçlü süresini etkiler. hücrelerde, kortikal çekme kuvvetleri mikrotübül artı sonları ve korteks ile ilişkili dinein arasındaki yük taşıyan ekleri oluşumu yoluyla oluşturulur. Hayvan hücrelerinde, bu ilişki Gαi 1 N-terminal miristoilasyon ile plazma membranına hedeflenen Gαi / LGN / numa kompleksi bağlıdır. Bu yeniden yapılanma tahlillerde, Gαi / LGN / numa kompleksinin gereksinimi doğrudan aracılığıyla biyotinile lipidler için dynein birleştirilmesi suretiyle atlanırbiyotin-streptavidin-biyotin kompleksleri oluşumu. Bu bağlar nispeten sabit (Kd ~ 10 -14 M) 37 ve hızla meydana (genellikle mikrotübül çekirdeklenme belirgin hale gelmeden önce, bir emülsiyon damlacık oluşumundan sonra, 10 dakika içinde) (Şekil 4b). Dinein yokluğunda, sentrozom damlacık korteks (Şekil 4c) karşıt kenarlarına itilir ise kortikal dinein mevcudiyetinde, sentrozom tipik haliyle, daha merkezi olarak korurlar. Biz Bunu önlemek ve mikrotübül iterek kuvvetleri karşı iki etkinin sonucudur muhakeme. (1) Dinein doğrudan mikrotübül felaketleri, böylece mikrotübül uzunluğu kısıtlayan ve aşırı mikrotübül burkulma önlenmesi ve (2) kortikal çekme kuvvetleri aster-aster itme kuvvetleri karşı bireysel asters 8, net merkezleme kuvvetlerine yol teşvik etmektedir. ASE1 f indükleyen yayılabilir çapraz bağlayıcıeğilimi orces anti-paralel mikrotübüllerin 29 örtüşen bölgeyi artırmak için. Bununla uyumlu olarak, (dinein ve yokluğu) ASE1 varlığında sentrozomlar ASE1 interpolar Mikrotübülleri (Şekil 4d) birlikte için lokalize ile birbirine yakın bulunmuştur. kinesin-5 aile fertleri (giriş bölümüne bakınız) mili içinden iterek güçleri sağlayarak sentrozom ayrımı sürücü. Cut7 (S. pombe kinesin-5 ortolog) varlığında, sentrozom da ASE1 (Şekil 4e) varlığında, emülsiyon damlacıklarının karşıt taraflarında itilir. kortikal ve inter-polar kuvvet jeneratörleri birleştirerek, karmaşıklık düzeyi daha nihayetinde bipolar mitotik iğ düzeneğinin kapsamlı bir anlayış neden bu deneylerde artırılabilir. Bu sonuçların detaylı niceliksel açıklamalar, gelecekte var olacak (Roth ve ark., Lığa). <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = "1"> zaman içinde sabit anlarda sentrozom konumuna dikkat ve mikrotübül gözlenen uzunlukları davranışlarını ilgili ek olarak, değerli bilgiler üzerinden konumlandırma işlemi uygulayarak elde edilebilir zaman. etki süreleri ve lazer yoğunlukları azaltarak, sadece ~% 30 ağartılması ile en az 1 saat boyunca 2 dakikalık aralıklarla aster konumlandırma takip etmek mümkündür. Bu merkezi aracılığıyla serbestçe difüzyon sentrozom gelen aster montaj ve konumlandırma izleme (0 dak.) Izin verir (12 dk.) Ademi asters (36 dk ve daha fazla) (Şekil 5c) için. Bu kararlı hal davranışı ve mili montaj kinetik hem de çalışma kolaylaştırır. Aynı numunedeki farklı içeriklerle damlacıkların birleştirerek, örneğin, mümkün olan doğrudan (Şekil 5B) ve kortikal güç jeneratörleri olmayan damlacıklar halinde sentrozom konumlandırma ve mil düzeneği kinetiğinin karşılaştırılması vardır. <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Şekil 1: Kuvvetler Mitotik Mil üzerinde hareket Çeşitli kuvvet üreten moleküller iğ oluşumunu ve konumlandırma teşvik etmek için mitotik milin mikrotübüller hareket.. Hücre korteks içine büyümeye mikrotübül sentrozom bir itme kuvveti oluşturur. (Mor) Kortikal dinein depolimerizasyon mikrotübülleri yakalar ve sentrozom üzerine bir çekme kuvveti oluşturur. PRC1 / ASE1 ailesinin çapraz bağlayıcılar bir kuvvet sürgülü dışa karşı oluşturmak ise mili içinde, kinesin-5 / Cut7 motor proteinler, anti-paralel mikrotübüller üzerinde dışa doğru kayar kuvveti sağlamak. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız . Şekil 2:. 4 mikroakışkan çipleri içeren 4 inçlik photomask mikroakışkan Chip Tasarım (A) tasarımı. (B) tek bir yonga detaylı gösterimidir. Fişleri bir çıkış kanalı ve bir toz filtresi ve ardından üç giriş kanalı ihtiva eder. Giriş kanalı 1 su fazı içeren, lipit / Yağ fazında ve kanal 3 2 kanallı ilave lipit / yağ-fazı ile oluşturulan damlalar seyreltilmesi için de kullanılabilir. (C) (üstten ve alttan gelen) lipit / yağ fazı (soldan geliyor) su fazı ile bir araya geldi kavşak detaylı gösterimi. Kavşakta, damlacıklar oluşturacak ve sağdaki çıkış kanalına doğru akar. (D) 2 mikron kanallı bir toz filtresi detaylı gösterimi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3:. Su içinde yağ emülsiyonu damla oluşumu için Yöntem (A) parlak alan mikroskop mikroakışkan çipi ve Mikroakiskan boru. Hem su ve lipid / yağ fazı tüpler, sırasıyla çip girişler 1 ve 2'ye bağlıdır. Su ve lipid / yağ safhaları karşılayan Mikroakiskan yonga üzerinde (B) Kısıtlama. basınçları değiştirerek, damlacıklar büyüklüğü kontrol edilebilir. PDMS kaplı akış hücrelerinin (C) tasarımı. akış hücre içine damlacıklar yükledikten sonra, açık uçları ek valap ile kapatılır. (D) damla oluşumunun şematik. Damlacıklar sentrozom, tubulin ve mitotik iğ formasyonu için gerekli olan ek bileşenler kapsüllenmesi için kullanılmaktadır. Kortikal-dynein hedefleme (E) şematik. Biyotinile (Bio) dynein streptavidin (STRP) aracılığıyla biyotinile lipidler hedeflenmektedir. <a= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg" target = "_ blank" href> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4:. Karmaşıklığı artırılması ile Mili-Reconstitutions Temsilcisi Sonuçlar (A), kısa, orta ve uzun mikrotübül örneklerini gösteren iki sentrozom içeren damlacıkların maksimum yoğunluğu projeksiyonları. Sentrozom ve mikrotübüller,% 10 HiLyte-488 tubulin etiketli ilave tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubukları 10 mikron =. (- Sol) ve streptavidin (STRP) varlığı (+, sağ) yokluğunda GFP biyotin-dinein-TMR (B) lokalizasyonu. Kortikal GFP-biotin-dynein-TMR (sağ +) – (sol) veya varlığı (C) Mikrotubul aster yokluğunda konumlandırma. (D) Mikrotubul aster (sol panel, green ASE1 varlığında) yerleştirme (orta panel, kırmızı). ASE1 ve Cut7 (kinesin-5) (orta panel, kırmızı) varlığında (E) Mikrotubul aster (sol panel, yeşil) konumlandırma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5: in vitro Görüntüleme Aster Konumlandırma Dinamikleri (A) birçok saat kadar için damlacık görüntüleme sağlayan bir PDMS fincan tasarımı.. (B) Üretimi, depolama ve damlacıkların görüntüleme floresan dekstran yokluğunda (solda) içerme (sağ) (Alexa 647) ile izah farklı içerikleri içeren (iletilen). (C) 60 dk time-lapse Tek düzlemi görüntüleri (2 dk aralıklarla) reklamın z-yığının (2 mikron mesafeler) alınanTek bir centrosome içeren roplet. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

yöntemleri su içinde yağ emülsiyonu damlacıkları temel mitotik iğ sulandırmak için burada mevcut son çabaları anlattı. geometrik sınırları içinde mili takımını okuyan birçok avantaj sağlamaktadır. Önemli geribildirim mekanizmaları mitotik iğin mikrotübüllerin ve monte edildiği geometrik kısıtlamaları arasında var. Mikrotübülüsler onlar mitotik iğ yerinden neden olabilir geometrik sınırları içine büyüyünce kuvvetleri itme üretebilir. Buna ek olarak, fiziksel bir engel büyüyen mikrotübül felaketler neden olabilir. Ayrıca, dar bir geometriye olan aks takımı da doğrudan mikrotübül büyüme oranı 36 etki gibi tübülin müstakil bileşenler, kademeli bir tükenmesine neden olabilir. Bunlar burada tarif edilen deneyler kullanılarak ele alınabilir mili montaj tüm temel belirleyicileri vardır.

tarif edilen deneyler, küçük bir konsantrasyon differe çok duyarlıdırDamlacık bileşenleri nces. Bu küçük konsantrasyon farklılıkları ya da çok yavaş ya da çok hızlı bir mikrotübül büyümesiyle sonuçlanır tubulin, için de geçerlidir. Bu durumda, mikrotübül büyüme oranları genellikle de Deneyin birinci ~ 30 dakika boyunca sıcaklığı ayarlanarak düzeltilebilir. Mitotik iğ takımı ve yerleştirilmesi de (kortikal) kuvveti jeneratör konsantrasyonundaki değişikliklere çok hassastır. Bu temizlenmiş bileşenlerin konsantrasyonu, saflık ve aktivitesine bağlıdır olasıdır ve her yeni saflaştırılmış protein için dikkatle takip edilmesi gerekmektedir.

Buna ek olarak, belirli bir dengeler tahlilin doğasına bağlı olarak, görüntüleme ayarlarında yapılmalıdır. Başlangıçta, çözünür floresan tübülin dimerleri yüksek seviyede görüntü bireysel mikrotübüllere güçleştirmektedir. mikrotübüller uzun büyümek ve çözünür tübülin yavaş yavaş tükenmiş gibi, sinyal-gürültü oranı giderek yüksek olur ve individu görüntülenmesine olanak tanımaktadıral mikrotübülüsler. Açık sistemlerde kurulumları aksine, geometrik sınırlandırıcı önemli bir ağartma sonuçlanan bir kütle rezervuar içinde floresan moleküller ve oksijen temizleme sistemi bileşenlerinin alışverişini önler. Özellikle, zaman içinde mili montaj ve yerleştirme kontrolü için, bu da güçlü bir oksijen tutucu sisteminin varlığında, düşük ışık yoğunlukları ile görüntü için gereklidir.

Bu yöntemler in vitro basitleştirilmiş aks-benzeri yapıların aşağıdan yukarı sulandırma sağlar. Burada tanıtılan bileşenlere ek olarak, diğer birçok faktöre vb 3 çift kutuplu spiralin teşekkülünün, konumlandırma, yönlendirme, şekillendirme, etkilemek için tarif edilmiştir. Bu sistem ayrıca ilave kuvvet jeneratörler bireysel ve kombine etkilerini incelemek için genişletilebilir. Bu sistem şu anda bulunmadığına iğ oluşumuna önemli katkıda mitotik kromozom vardır. Mitotik kromatin gösterilmiştir'polar-çıkarma kuvvetleri' 3, (2) kromatin bağlı RanGEF RCC1 38 tarafından RanGTP degrade oluşumu, (3) kinetokorlar (depolimerizasyon ile etkileşimde bulunabilirsiniz sözde meydana getirebilirler (1) chromokinesins doğrudan mili oluşumu ) mikrotübüller 39 ve (4) karşıt mikrotübüllerin 40 arasında-mekanik bir yay gibi işlev görebilir kromatin kendisi.

Son olarak, açıklanan sistem şu anda sınırlı zamansal ve mekansal aktivite üzerinde kontrol ve tanıtılan kuvvet jeneratörlerin lokalizasyonu sağlar. hücrelerinde, bir çok mil takımı faktörler, belirli bölümlerinde lokalize veya sınırlı bir zaman aralığı içinde etkilidir. Çarpıcı bir örnek özellikle C arka tarafında zenginleştirilmiş dinein aktivitesi olduğunu elegans tek hücreli aşamada embriyo asimetrik iğ konumlandırma ve hücre bölünmesini teşvik etmek. Bu sistemde, şu anda böyle bir t taklit olasılığını araştırıyoropto genetik tekniklerle ödünç emporal ve asimetrik aktivite kullanarak yöntemleri. Buna ek olarak, aynı C için geçerlidir elegans embriyo ve sert hücre duvarı ile hücreler, birçok hücre mitoz kadar yuvarlak değil. Geometrik hapsi şekli miline 41 üzerinde etkili kuvvetlerin üzerinde temel bir etkiye sahip olacaktır. Nedenle potansiyel olarak şekillendirme ve emülsiyon depolanması 42,43 damlacıkları izin daha karmaşık mikroakışkan sistemleri kullanarak, hem de küresel olmayan damlacıkları mili montaj ve konumlandırma sulandırmak için önemli olacaktır. Son olarak, doku, hücre-hücre ve hücre-alt-tabaka sinyal ve bağlantı genellikle epitel hücrelerinde olduğu gibi, yönlendirilmiş mili yönünde çevrilebilir dış işaretlere sağlar ve kök hücreleri. Bu özel tüm yönleriyle bu çalışmada dikkate alınmamıştır ve mitotik iğ assemb in vivo benzeri daha reconstitutions doğru inşa etmek için gelecek zorlukları sağlayabilirly ve konumlandırma.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

Materials

1. Preparation of microfluidic chips
Photomask (Photomask on film substrate) Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025 MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) WRS Materials 4P0SSP-005
Spin coater  Polos SPIN150I
PDMS pre-polymer RVT615 A+B Lubribond 9481
Corona treater Electro-technic products BD-20ACV
2. Microfluidic setup
Name Company Catalog Number Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) Avanti Polar Lipids 840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) Avanti Polar Lipids 870285
Chloroform Sigma-Aldrich 650498
Glass pipets
Glass tubes
Vacuum pump Laboport KNF
Vacuum chamber Kartell Polypropylene Vacuum Desiccator
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Surfactant (Span80) Sigma-Aldrich 85548
Sonicator Branson M2800H
Coverslips 24x60mm, thickness 1.5
Glass-slides 26x76mm
Puncher Harris Uni-Core 135840/135841/135843
Laboratory sealing film Parafilm
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) Home made
Brightfield Microscope Leica PMIRB  Any inverted brightfield would suffice
Pressure controler Fluigent MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing Cluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) VWR, The Netherlands
3. Reconstituting spindle formation and positioning
Name Company Catalog Number Comments
Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) Life Technologies
Tween-20 Sigma-Aldrich
BSA – Bovine serum albumin Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) Sigma-Aldrich G6125
DTT (DL-dithioltheitol) Sigma-Aldrich 646563
Catalase (Catalase form bovine liver) Sigma-Aldrich C9322
Tubulin (Tubulin from bovine brain) Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) Sigma-Aldrich 51120
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) Sigma-Aldrich C0406
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) Beckman-Coulter CLS
4. Introducing spindle-assembly factors
Name Company Catalog Number Comments
Neutravidin Sigma-Aldrich A2666
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A9187
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) Sigma-Aldrich P0564
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) Sigma-Aldrich P0294
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
  2. Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
  3. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
  4. Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
  5. Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
  6. Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  7. Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
  8. Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  9. Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
  10. Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
  11. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  12. Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
  13. Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
  14. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
  16. Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
  17. Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
  18. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  19. van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
  20. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
  21. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
  22. Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
  23. Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
  24. Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
  25. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  26. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  27. Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
  28. Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
  29. Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
  30. Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
  31. Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
  32. Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).
  33. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
  36. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  37. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  38. Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
  39. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  40. Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
  41. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
  42. Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
  43. Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).

Tags

Mitotic SpindleSpindle AssemblyCellular ConfinementPDMSMicrofluidic ChipsLipidsMineral OilSurfactantSpin CoatingVacuum ChamberCuringCover GlassesGlass SlidesFlow Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets. J. Vis. Exp. (114), e54278, doi:10.3791/54278 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image