영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
영양막 줄기 세포 (의 TSC)는 포유 동물 발달에서 제 1 셀의 운명 결정의 결과로서 발생한다. 그들은 자기 갱신과 태반의 태아 부분에 세포 인구주는 상승 줄기 생체에 해당 영양막 세포 계보의 모든 하위 유형으로 분화 할 수있는 능력을 유지, 체외에서 배양 할 수있다. 따라서,의 TSC는 체외에서 여분의 배아 세포 운명 결정 대 태반 개발 및 배아를 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이후 배반포 단계에서 DNA 메틸화와 히스톤 수정 구성된 별개의 후생 유전 학적 장벽은 단단히 두 계통을 분리한다. 여기, 우리는 완전히 과발현 쥐의 배아 섬유 아세포에서 영양막 세포 키 규제 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2의 과도하여이 혈통의 장벽을 극복 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유도 영양막 세포의 줄기 세포는 자기 갱신 할 수 있습니다 및 파생 영양막 세포의 줄기 세포를 배반포 거의 동일하다 내가형태, 마커 유전자 발현과 메틸화 패턴 N 조건. 생체 외 및 생체 내 분석 기능은 이러한 세포는 영양막 세포의 혈통이 배수체 영양막 세포 거대 세포를 생성하고 포배에 주입하면 태반을 chimerizing 따라 차별화 할 수 있는지 확인합니다. 체세포 조직에서 영양막 줄기 세포의 유도는이 엑스트라 배아 혈통 유전자 및 후생 유전 학적 특성을 연구하는 새로운 길을 열고 각각의 배아를 파괴하지 않고 영양막 줄기 세포주를 생성하기위한 가능성을 제공한다.
Introduction
최근 줄기 세포 변환을 영양막하는 마우스 배아 줄기 세포의 여러 가지 접근 방식을 비교하는 연구는 모든 분석 시스템에서, 혈통 전환이 불완전 남아 있음을 밝혔다. 대신 그래서 영양막 줄기라고 유도 영양막 줄기 세포 (iTSCs)의 세포 유사 세포가 기원 한 세포의 운명의 메모리 유지 생성되었다. 여기, 우리는 ITSC 세대의 다른 접근 방식을 따랐다. 쥐 배아 섬유 아세포 (MEFs에) (2)로부터 다 능성 줄기 세포의 직접 유도와 유사하게, iTSCs 직접 분화 된 체세포 조직에서 변환되었다. 첫째, 우리는 MEFs에에서 과발현 때 TSC의 운명을 유도 (12) 후보 요인을 확인했다. 나중에, 요소 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2는 ITSC 유도 3 필요하고 충분한 것으로 확인되었다. 동시에, 다른 그룹은 독립적으로 iTSCs에 MEFs에 변환 할 충분한 것으로 Tfap2c, GATA3 및 Eomes를 발견했다. 그러나,에 그연구는 유전자 발현을 위해 필요한 시간이 상당히 길어 Ets2는 분화 칵테일 4에없는 경우에는, 다른 전환 반응 속도를 나타내는 연구와 비교된다.
유도 배반포 영양막 유래 줄기 세포의 배양을 포함하는 종래의 소 태아 혈청 (FBS)을 성장 비활성화 MEFs에 5,6- 분비 인자의 존재에 의존한다. ITSC 유도하는 동안, 이러한 요인은 유전자의 전체 조합이 부족 분화가 진행되지 않습니다 MEFs에 의해 제공됩니다. 그러나 한 번 개인 ITSC 식민지 그들은 성장 비활성화 MEFs에 의해 미리 조정 된 미디어를 필요로 계대 배양합니다. 거기부터 iTSCs 배양 및 표준 프로토콜에 따라 배반포 유래의 TSC처럼 취급 할 수 있습니다. 참고로, 세포 배양 접시를 겔화없이 다나카 등. (5) 우리가 일상적으로 배양의 TSC와 iTSCs 대조적.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 4 인자 (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 기반으로 분화 프로토콜은 충실하게 생성 마우스 배아 섬유 아세포에서 iTSCs을 변환 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 또한, 상기 방법은 비록 배아 섬유 아세포 (3)에 비해 효율의 저하로도 산후 테일 섬유 아세포에 적용된다. 일반적으로, 기본 섬유 아세포의 분화 품질 결과 및 치료의 중요한 요소가 초기 통로 세포 (통로 3-2)를 사…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
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