母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

実験は、ヘルシンキ宣言で表現原則に従って実施しました。この研究は、カリフォルニア大学の治験審査委員会、サンフランシスコ（CHRの＃11から05530）によって承認されました。すべての患者は、サンプルとその後の分析の収集のための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。組織を脱同定検体として採取しました。 注：研究者がその制度ヒト被験者の審査委員会の承認を得なければなりません。妊娠歴または胎盤異常に基づいて試験片の除外は、特定の研究のニーズに応じて異なります。 注：適切な安全条件（バイオセーフティーレベル2）は、このプロトコル12のすべてのステップのために利用されるべきです。 コレクションの日の前に1.準備、 オートクレーブストレーナー/収集のための鉗子、および顕微解剖用ハサミ/ピンセット。 十分な洗浄緩衝液の量（試料あたり500ミリリットル）（再準備）レシピについては、 表1にFER。 0.22μMの滅菌濾過されたコレクションのメディアの適切な量を（試料当たり100ミリリットル）（レシピについては表1を参照）を準備します。 一定分量外マトリックス（ECM、詳細については、 試薬の表を参照）長期保存のために。 -20℃で固体の形で保管ECM。最高のパフォーマンスを得るために、繰り返し凍結融解を避けます。雪解け4℃で粘性の溶液に、ボトル、およびチルドピペットチップと低温室で300μlのアリコートを準備します。分注して-20℃で保管。 新鮮な組織の2コレクション注意：新鮮なヒト組織で作業する場合、研究者は血液媒介病原体の伝播を防止するためのユニバーサル注意事項（OSHA）に従う必要があり、適切な制度的な訓練を受けていなければなりません。手袋、眼の保護、および白衣を含む適切な個人用保護具は、必要です。 輸送オートクレーブ・ストレーナ（試料ごとに）、オートクレーブ、鉗子、洗浄緩衝液（カーボイ）、収集培地（50mlコニカルチューブ内の試料につき25 ml）で、スプレーボトル、10％漂白剤、70％エタノール、組織収集トレイ、シャーピー、およびアイスバケット/病院/診療所にクーラー。 注：標本は手術室に近い部屋に位置する研究指定空間に収容されます。滅菌組織培養フードは必須ではありませんが、コレクションが迅速に行われるべきと以下に説明するように、研究者は、表面を適切に消毒する必要があります。 ウォッシュの場所カーボイをシンクに隣接バッファー、10％の漂白剤、70％エタノールで栓をスプレー。光源（光パッドやライトボックス）に置き、ガラス組織収集トレイ、および10％の漂白剤、70％エタノールで消毒します。空気乾燥することができます。 試料準備室に手術室から臨床医のキャリー標本を持っています。シンクでは、組織を数回すすぎ、滅菌手持ちストレーナの上に試料を注ぎました時間バッファは、光源の上に消毒ガラストレイにバッファ内の標本全体を転送します。 注：臨床医による組織の評価が最優先であり、臨床医は口頭で彼/彼女は、評価が終了したことが示された後、このようにして、次の手順をのみ実行されます。 コレクションの胎盤の絨毛および脱落膜（ 図2Aと3A）を選択し 、50ミリリットルコニカルチューブを分離するために転送するために滅菌ピンセットを使用してください。妊娠期間でチューブにラベルを付けます。 注：優先在胎齢は、それぞれ、9未満週間で、胎盤および脱落膜未満16週間。機関では、各試験片の一部だけは、適切な組織は、臨床病理学的診断のために維持しなければならないとして、研究目的のために調達されています。 研究室に氷上で保存および輸送標本。 コレ間に10％漂白剤、70％エタノールを用いて上記のように複数の試料を収集するために、ガラストレイをサニタイズ各試験片のction。 器官培養プレートの調製注：以下の手順は、組織培養フード内で無菌技術を使用して行われるべきです。解剖顕微鏡は、無菌領域内に配置されることが理想的です。しかし、これは、長い微小切開が迅速に行われ、器具は、70％エタノール中で頻繁に浸漬するように絶対的に必要ではありません。 氷上で解凍ECMバイアル（複数可）。ピペッティングにより混合し、氷冷コレクション培地で1：ECM 1に希釈します。ピペットは、ゆっくりと気泡を導入しないようにします。 6ウェル組織培養プレートの各ウェルは、この懸濁液100μlを必要とし、3-4器官培養物を収容します。 6ウェル組織培養プレートの各ウェルに置きトランスウェルインサート（孔径0.4μM）。 コー​​トは、各ECM /メディア懸濁液の薄層（100μl）を用いて挿入するトランスウェル。 氷の上にプレートを置き、すぐにestablishmenに進みます器官培養のトン。また、前、後の使用のために4℃でパラフィルムや店舗でそれをラップし、その場合には組織収集にプレートを準備します。 ECMが乾燥ますように長い6時間以上保管することはお勧めできません。 4.設立オルガンの文化注：この手順は、別のトランスウェルに脱落膜器官培養および絨毛器官培養を配置する方法について説明します。組織が接触していません。脱落膜及び絨毛が互いに直接接触している共培養技術に興味を持って研究者らは、先行文献9,10を参照することができます。 コレクション媒体に二回の試験片をすすぎ、各すすぎの間千×gで遠心。解剖顕微鏡のステージ上に滅菌ペトリ皿や場所に組織を転送します。顕微鏡に隣接し、氷上で6ウェルプレートを保管してください。 、ハサミやピンセット解剖滅菌スプリンガーで組織をマイクロ解剖2〜3ミリメートル絨毛器官培養を確立するために、S（ 図2A）。 注：絨毛器官培養は、2または3支店を持つ、著名な絨毛外栄養膜（EVT）セル列11と小、よく血管新生した「木」です。 ECMへの絨毛外栄養膜の侵入が最もこれらの若い年齢13で発音されるように、<9週妊娠初期の検体からのみ絨毛組織を活用することが重要です。 著名なEVTセル列とよく血管新生した絨毛を選択します。 EVTセル列は球根、「ファジー」、「ふわふわ」が終了する（ 図2（a）の矢印の先を参照）として可視化されます。 各トランスウェルに3または4絨毛木を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。ツリーがECMと個別の凝集した枝の上に平らに配置されているように枝を調整します。 3ミリメートル3脱落膜器官培養（ 図3A）を確立するために、無菌スプリンガー解剖ハサミやピンセットで脱落膜組織をマイクロ解剖。 注：標本は2投を含んで（左右の組織片、 図3A）脱落膜組織、壁側脱落膜と被包脱落膜の着色したタイプ。 壁側脱落膜の3ミリメートル3作品を作成するために、はさみで切り取ります。被包脱落膜は、これらの培養のために使用されていません。任意の凝固母体血を離れていじめるために鉗子を使用してください。 各トランスウェルの中に脱落膜の3-4個を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。 井戸の底に収集メディアの1ミリリットルを追加します。 5％CO 2中で37℃で一晩プレートをインキュベート実験のためには、正常な妊娠初期の胎盤の酸素張力を模倣する相対的な低酸素（3％O 2）で絨毛器官培養を維持することが重要です。 注：研究室のオプションは、小さな既存のインキュベーター内に収まる低酸素インキュベーター室、または酸素濃度を低下させるために外部のN 2ガ ​​スを導入し、トライガスインキュベーターが含まれます。 （絨毛または脱落膜培地の1ミリリットルを追加タブル1）トランスウェルの上部に文化の12-16時間後。 注：文化の中で最初の一晩の間にメディアが存在しない場合は、絨毛外栄養膜細胞の列が（絨毛文化）に侵入することを可能にし、組織のために（絨毛および脱落膜の両方）しっかりとECMに埋め込まになること。我々の経験では、脱落膜器官培養は、96時間、72時間および絨毛器官培養に生存したまま。我々は、この時間枠内に収まる実験のエンドポイントをお勧めします。絨毛および脱落膜培地の組成については、 表1を参照してください。脱落膜媒体が脱落膜化状態（ 表1）を維持妊娠ホルモン（プロゲステロン、17βエストラジオール）を補充しながら絨毛培地は、FBSの高い割合を有します。 L. 5.準備モノサイトゲネスの文化注：L.の長期保存に関する詳細なプロトコルの場合モノサイトゲネス 、及びTHIの文化と成長ブレインハートインフュージョン（BHI）ブロスおよび寒天中の生物は、Wang らを参照してください。14 単一L.ピック画線BHI寒天プレートからコロニーをモノサイトゲネスおよびBHIブロスの3ミリリットルを接種します。 L.をインキュベート30℃で、斜めの位置で、一晩（16時間）文化をモノサイトゲネス 。 注：これらの培養条件は、細菌増殖が定常期に到達することを可能にするL.モノサイトゲネスは、宿主細胞の浸潤15を増加させる30℃にて鞭毛れます。 L.との器官培養の6感染モノサイトゲネス 温かいPBSおよび絨毛または脱落膜媒体（ 表1）37℃です。 ECMに侵入しなかったため、十分に浮遊している任意の器官培養片を除去するために滅菌ピンセットを使用してください。 慎重にトランスウェルの底からメディアを吸引除去します。静かに戦争の1ミリリットルをピペットで二度、上下のトランスウェルをすすぎますウェルにPBSをM、と慎重の間で吸引します。優しく上下のトランスウェルに抗生物質を含まない絨毛または脱落膜メディアの1ミリリットルをピペット。器官培養を乱さないように注意してください。 組織は、抗生物質が除去されていることを確実にするために、少なくとも時間抗生物質を含まない培地中でインキュベートしてみましょう。 注：L.の固定相での密度モノサイトゲネスの文化はミリリットル当たり約1×10 9コロニー形成単位（CFU）です。器官培養物を感染させるために使用される細菌の数は、実験的なニーズを満たすために経験的に決定されるべきです。 野生型L.のためにモノサイトゲネスルーチン感染実験は（ウェルあたり培地1ml中に4×10 7 リステリア菌 ）一晩の1:50希釈で堅牢な侵入を示しています。抗生物質を含まない絨毛または脱落膜媒体中の細菌の数を適切に再懸濁します。 トランスウェルの上部から吸引したメディア。静かに接種物の1ミリリットルを追加します。 37でプレートをインキュベート細菌の侵入を可能にするために、5％CO 2でC°。 上下のトランスウェルから培地を吸引することにより、細胞外細菌を除去します。温かいPBSでウェルを2回洗浄します。 50μgのml -1のゲンタマイシンを補った絨毛または脱落膜メディアの1ミリリットルを追加します。 5％CO 2中37℃でプレートをインキュベートします。 注：L.モノサイトゲネスは 、細胞外の培地中で増殖する細胞の内部で成長し、細胞外空間にアクセスすることなく、細胞間から広がる可能性が通性細胞内細菌です。ゲンタマイシンは、細胞外L.に殺菌効果がありますモノサイトゲネス 、したがって細胞内のLの測定を可能にします成長をモノサイトゲネスおよび器官培養16を介して広がります。 注：再現性L.絨毛および脱落膜器官培養のモノサイトゲネス感染は5時間のインキュベーション時間で発生します。ゲンタマイシンの添加前のインキュベーション時間は、実験的なニーズおよびABに基づいて修正することができます組織に侵入する生物のility。より良好な感染の最も脆弱な解剖学的部位を理解するために、より短いインキュベーション時間は2を使用することができます。 実験期間中、5％CO 2中37℃でプレートを維持します。各ウェル毎日でメディア全体を変更します。 注：私たちの経験では、L.感染し脱落膜器官培養は、72時間、48時間および絨毛器官培養に生存したままモノサイトゲネス 。 組織病理学のための7ハーベストオルガンの文化 30ミリリットルのPBSで16％の株式アンプルの10ミリリットルを希釈することにより、4％パラホルムアルデヒドの新鮮な溶液を調製します。 4°Cで保存4％パラホルムアルデヒド、光から保護され、1週間以内に使用します。使用前に室温に持参してください。 上下のトランスウェルから培地を吸引。ゆっくり室温でPBSでウェルを2回すすぎます。静かに完全に器官培養をカバーするために上部トランスウェルに1ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを追加します。 インキュベート20分間室温で4％パラホルムアルデヒドです。これは組織の過剰な固定につながる可能性があるとして、より長いインキュベーション時間を避けてください。 吸引しパラホルムアルデヒド、室温でPBSでウェルを2回すすぎます。 （「凍結固定」）10月媒体、凍結、クライオスタットのセクションにおける固定器官培養を埋め込みます。一般的には、固定凍結組織は、固定前なしの凍結組織よりセクションに容易です。 注：10月の埋め込 ​​みや凍結切片上で完全なプロトコルについては、公表されたプロトコル17,18から関連するセクションにアクセスしてください。実験的なニーズや利用可能な実験装置やストレージに応じて、組織ではなく、パラフィン包埋し、ミクロトーム19に区分することができます。 さらにルーチンヘマトキシリン＆エオシン染色、免疫蛍光法、または免疫組織化学18,20,21のための組織スライドを準備します。