Legame dell'anticorpo Specificità per Kappa (Vκ) umani (IgM) Anticorpi catena contenenti chiari: Polysialic Acid (PSA) Allegato alla NCAM come caso di studio

protocolli e le procedure di animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvate dalla cura degli animali e sull'uso di comitati istituzionali della Mayo Clinic (Mayo IACUC numero di protocollo # A51912). 1. Generale CNS Preparazione del tessuto Genera NCAM carente (KO) topi su C57 / BL6 sfondo (gentilmente fornito dal Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), i topi eterozigoti NCAM e wild-type (WT) fratellini (C57 / BL6) attraversando eterozigoti. La genotipizzazione dei topi NCAM KO è stato descritto in precedenza 32-34 e non verrà spiegato in ulteriore dettaglio. Nota: i passaggi 1,2-1,6 sono opzionali. Prima dell'intervento, somministrare una soluzione di pentobarbital (immagine: 25 mg / ml; 50/100 ml di pentobarbital per rispettivi stadi adulti postnatale precoce) tramite iniezione intraperitoneale (ago calibro 27 e 1 mlsiringa). Attendere per 2 minuti o fino a quando l'animale ha raggiunto un piano chirurgica di anestesia. Somministrare anestesia aggiuntiva necessaria nel corso di ogni operazione di mantenere un piano chirurgica di anestesia. Utilizzare punta metodo pinch-risposta per determinare la profondità dell'anestesia. Gli animali devono essere non rispondere prima di continuare. Fare un 0,5 – incisione laterale 1 centimetro attraverso il tegumento e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica. separare con cura il fegato dal diaframma. Fai una piccola incisione nel diaframma utilizzando una curva, forbici spuntate. Continuare l'incisione membrana lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Posizionare curvi, forbici smussate lungo un lato della gabbia toracica, spostando attentamente i polmoni, e fare un taglio attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Fare un taglio simile sul lato controlaterale. Sollevamento sterno via, tagliare con cura qualsiasi tessuto collegandolo al cuore. Fare un'incisione all'animaleE 'per atrio destro usando forbici iris per creare più grande uno sbocco possibile. Iniettare lentamente 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) nel ventricolo sinistro dell'animale (luce rossa; portata: 1 ml / min) utilizzando una siringa da 10 ml dotato di ago calibro 27. Non aumentare il flusso / PBS pressione durante la perfusione per evitare la distruzione dei tessuti. Decapitare topi neonati utilizzando forbici chirurgiche. Rimuovere il cervello afferrando le orbite con una pinza e con l'inserimento di una piccola forbice nella colonna vertebrale. Tagliare il cranio verso la parte anteriore a livello dell'orecchio. Staccare il cranio e delicatamente mettere il cervello in un piatto 60 millimetri Petri riempite con 10 ml di terreno dissezione ghiacciata su ghiaccio (Tabella 1). Luogo ogni cervello in una provetta da 1,5 ml e subito memorizzare sul ghiaccio secco (-79 ° C). Incidere il gambo cervelletto e cervello dai cervelli congelati utilizzando una lama di rasoio pulito sul ghiaccio. Lavorare velocemente per evitare lo scongelamento del tessuto. pesare ilcervello congelato, messo in un tubo da 15 ml su ghiaccio e aggiungere tampone di lisi ghiacciata (vedi Tabella 1) ad una concentrazione finale di 150 mg di tessuto cerebrale per microlitri tampone di lisi. Ripetere l'operazione per cerebra rimanente. Mantenere il cervello su ghiaccio in ogni momento per misure 1.9 – 1.11. Omogeneizzare cervelli in tampone di lisi da triturazione attraverso un puntale 1 ml (10 volte), seguita da triturazione attraverso una siringa da 5 ml equipaggiato con ago calibro 27 (10 volte). Incubare lisati cerebrali per ulteriori 30 min in ghiaccio per permettere la lisi del tessuto completo. Rimuovere il materiale e il cervello lipidi detergente-insolubili attraverso centrifugazione di serie (quattro turni a 19.000 xg per 10 min a 4 ° C). Scartare (bianco) mielina e detriti cellulari contenenti pellet, ma mantenere il surnatante dopo ogni fase di centrifugazione. lisati cervello aliquote e conservare a -80 ° C. 2. Utilizzo immunoprecipitazione IgM umana (HIgM12 e Isotipo controllo IgM) come un "pull-down" Agent dal Cerebral lisati di WT e NCAM KO Mice Proteine ​​L Agarosio Bead Preparazione 9,35,36 Preparare 200 ml di tampone IP tra cui BSA (vedi tabella 1). Preparare altri 200 ml dello stesso tampone IP senza BSA. Per immunoprecipitazione trasferimento reazione 100 ml di proteine ​​L agarosio liquame con una pipetta 200 ml in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Non proteine ​​vortice perline L agarosio! Aggiungere 1 ml di tampone IP (vedi Tabella 1) ad ogni provetta. Mescolare Proteine ​​L agarosio e tampone IP manualmente tramite inversione (cinque volte). Lavare proteina L agarosio perline quattro volte per centrifugazione in una centrifuga da banco (1000 XG, 2 min, 25 ° C). Togliere il surnatante con una pipetta 200 microlitri senza disturbare il pellet agarosio. Ripetere i passaggi da lavaggio 2.1.2 a 2.1.3 altre tre volte. Equilibrare proteina L agarosio in 1 ml di tampone IP appena aggiunto un rullo notte a 4 ° C. Antigene-anticorpo-Agarose L formazione del complesso e Antigen Detection in Western Blot Incubare 30 mg di tessuto cerebrale lisate (~ 200 microlitri lisato) in 1 ml di tampone IP ghiacciato con 20 mg di anticorpo IgM (HIgM12) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga notte su un rullo a 4 ° C. Spin down perline agarosio proteina L (dal punto 2.1.4) in una centrifuga da banco per 2 min a 1000 xg, 4 ° C. Eliminare il surnatante con una pipetta 200 microlitri senza disturbare il pellet agarosio. Aggiungere la soluzione raffreddata anticorpi cervello lisato (dal punto 2.2.1) alla proteina L agarosio usando una pipetta 1 ml. Incubare la antigene-anticorpo-proteina sospensione L agarosio per 2 ore su un rullo a 4 ° C. Lavare il complesso antigene-anticorpo attaccato alla agarosio L tramite centrifugazione a 1.000 xg per 2 minuti, 4 ° C. Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 1 ml di tampone IP ghiacciata contenente 0,2% di BSA. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta utilizzando IP Buffer ghiacciata contenente 0,2% di BSA e altre due volte con tampone IP gelida, senza BSA. Spin down complesso antigene-anticorpo attaccato al agarosio L a 1.000 xg per 2 minuti, 4 ° C. Scartare il surnatante completamente prima con una pipetta 200 microlitri fino ~ 50 ml di soluzione vengono lasciati in cima al pellet agarosio proteina L seguita da una pipetta 10 microlitri. I campioni in ghiaccio. Aggiungere 40 ml di tampone di eluizione IP (vedi Tabella 1) per provette da 1,5 ml microcentrifuga, tubi flick dita 6 volte e calore per 5 minuti a 95 ° C. Mettere i campioni in ghiaccio per 2 minuti e spin down per 30 sec a 13.000 xg, 4 ° C. Trasferire il surnatante con una pipetta 10 ml (~ 35 microlitri totale) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga fresco senza disturbare il pellet. Conferma assenza di perline Protein L agarosio risciacquando giù una piccola quantità del campione eluito alla parete interna del tubo. Nota: "granulare"proteina L perline agarosio sono chiaramente visibili se presente. Se perline proteina L agarosio sono presenti, spin down di esempio per altri 30 secondi a 13.000 xg e trasferire il surnatante per pulire il tubo. Ripetere il passaggio fino a quando non perline agarosio sono rilevabili. Carico 10 – 20 ml di campioni eluite per pozzetto su gel di SDS-poliacrilammide in un sistema tampone Tris / glicina / SDS (vedi Tabella 1). Nota: Utilizzare 7,5% o 4 – 20% gel gradiente con 50 microlitri volume di carico per pozzetto per la rilevazione delle isoforme NCAM (dimensioni gel (L x L x spessore PSA-NCAM o: 8.6 x 6.7 x 0.1 cm). Gel corsa per ~ 1 ora a 100 V (1,74 V / cm 2) sul banco. Ulteriori raffreddamento non è richiesto per questo passaggio 37,38. Proteine ​​Trasferire PVDF (polivinilidenfluoruro) membrana (dimensione dei pori 0,45 micron) per 2,5 ore in cella a 100 V (1,74 V / cm 2) utilizzando buffer di trasferimento fredda (5 – 10 ° C) (vedi Tabella 1). membrane blocco with 10% (w / v) di latte in polvere secca in PBS-T per 1 ora a 25 ° C su un agitatore orbitale da banco, lavare le membrane due volte per 10 minuti con PBS-T e sonda overnight con anticorpo primario in 5% BSA in PBS- T in un agitatore orbitale a camera fredda. La mattina successiva membrane lavata una volta brevemente con eccesso di PBS-T a 25 ° C (includa coperchio e del contenitore) seguito da 3 lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno in un agitatore orbitale (80 rpm) (tutti i lavaggi vengono eseguiti a 25 ºC). Aggiungere anticorpo secondario (perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti- IgM-anticorpo anti-umano (per HIgM12) (diluizione 1: 30.000) in 5% di latte in polvere secca in PBS-T per 1 ora a 25 ° C su un agitatore orbitale (70 giri ). membrane Lavare estesamente una volta brevemente con eccesso di PBS-T a 25 ° C (includono coperchio e del contenitore) seguito da 3 lavaggi con PBS-T per 10 minuti ciascuno in un agitatore orbitale (80 rpm) (tutte le fasi di lavaggio sono eseguite a 25 ° C) . Mescolare 1 ml di freddo maggiore chemiluminescence HRP componente substrato A (enhanced reagente luminol) con 1 ml di componente B (reattivo ossidante) (per Mini macchia) a 25 ° C. Utilizzare pinze plastica per trasferire le membrane su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso (tenerli ai bordi molto). contenitori asciugare con carta assorbente e membrane rimettere in contenitori (uno per ogni membrana). Immediatamente aggiungere 2 ml della chemiluminescenza HRP substrato premiscelata (composto A + B) (step 2.2.16.) per ogni membrana e incubare per 2 minuti a 25 ° C su un agitatore orbitale (90 rpm). Assicurarsi che le membrane sono uniformemente inumidito con il reagente chemiluminescenza. Trasferimento membrane in un manicotto di plastica trasparente ed eliminare liquidi e l'aria in eccesso bolle con carta assorbente. Mettere membrane in manica di plastica in un rullino ed eventualmente il nastro il manicotto di plastica nella cassetta. Chiudere la cassetta. Prendere la cassetta, film, timer e forbici nella camera oscura. Tagliare in alto a destra di ogni film a fini di orientamento, esporre (diversi) film per diversi periodi di tempo (10 sec, 1 min, 10 min) e sviluppare film in uno sviluppatore film. 3. Endoneuraminidase-NF digestione di PSA Attaccato alla NCAM 39 Digest tessuto cerebrale lisato dal primo giorno post-natale (P) 7 topi WT e topi P7 NCAM KO (preparato dal punto 1.12) per 2 ore su ghiaccio con endoneuraminidase-NF (endo-NF), come illustrato nella tabella 2 39. Aggiungere 5 ml di tampone campione 4x Laemmli ad ogni provetta (1 – 6) dal punto 3.1 (Tabella 2). Caricare i campioni su un 4 – gradiente di gel e ripetere SDS-poliacrilammide 20% passi 2.2.10 a 2.2.19. membrane sonda con HIgM12 (1 ug / ml), disponibile in commercio anti-PSA mAb (clone 2-2B) (1 ug / ml) e anticorpi (controllo del carico) β-actina (1 mg / ml) in 5% BSA in PBS -T. 4. Preparazione di Rat e Culture del mouse del sistema nervoso centrale <strong> Preparazione di vetrini di vetro Acid-lavaggio vetrini 25 mm in 1 M HCl a 50 – 60 ° C per 4-16 ore in una cappa aspirante con un contenitore di vetro. Agitare coprioggetto di tanto in tanto attraverso delicata vorticoso. Lavare vetro coprioggetto ampiamente in acqua distillata (3x). Assicurarsi di lavare l'acido tra le lamelle sovrapposte. Lavare coprioggetto in 100% di etanolo e asciugare su Parafilm in una cappa di coltura cellulare. Un giorno prima dell'uso, riscaldare i vetrini per 24 ore in un contenitore di vetro con coperchio a 100 ° C in un forno. Mettere coprioggetto di vetro in 6-ben piatto e cappotto con 3 ml di 40 mg / ml di poli-D-lisina in acqua sterile per 1 ora a 37 ° C. Lavare due volte con acqua sterile, asciugare completamente sotto il cofano coltura cellulare e applicare la luce UV per 20 min. Preparazione del Tissue Culture plastica per cellule del SNC Coat 60 mm piatti di coltura cellulare o 75 cm fiasche di coltura tissutale 2 con 3ml ml o 10, rispettivamente di 40 mg / ml di poli-D-lisina in acqua sterile per 1 ora a 37 ° C. Lavare due volte con acqua, asciugare completamente sotto il cofano coltura cellulare e applicare la luce UV per 20 min. Rat mescolato Glia isolamento 40 Anestetizzare ratti neonati in IACUC approvato roditore camera di eutanasia con CO 2 di alimentazione del gas (completamente automatizzata). Utilizzare punta metodo pinch-risposta per determinare insensibilità dell'animale. Decapitare neonatale ratti Sprague Dawley (P0P1) (6 – 10 cuccioli alla volta). Rimuovere il cervello afferrando le orbite con una pinza e con l'inserimento di una piccola forbice nella colonna vertebrale. Tagliare il cranio verso la parte anteriore a livello dell'orecchio. Staccare il cranio e delicatamente mettere il cervello in un piatto 60 millimetri Petri riempite con 10 ml di terreno dissezione ghiacciata sul ghiaccio (vedi tabella 1). Ripetere l'operazione per i restanti cuccioli di ratto (6 – 10 cuccioli). Mantenere il tessuto in ghiaccio per gradini 4.3.2 – 4.3.7. </li> Dividere il cervello lungo la linea mediana in due emisferi cerebrali e successivamente tagliare bulbi olfattivi, gangli della base al di sotto della corteccia cerebrale e nell'ippocampo con una pinza Dumont. Posizionare il isolato corteccia cerebrale in un piatto pulito Petri contenente dissezione media sul ghiaccio. Prendete una corteccia. Rimuovere le meningi con una pinza con punte sottili al microscopio dissezione. Ripetere con gli altri cortecce. Mettere tutte le cortecce-meningi libere in uno pulito capsula di Petri sul ghiaccio. Combinare gli emisferi corticali da tutti i cuccioli in 60 mm piastra di Petri e utilizzare una lama di rasoio sterile per dadi il tessuto cerebrale in 1 mm pezzi tritate. Trasferire il tessuto cerebrale tritato con una pipetta 10 ml in un pallone sterile, non patinata da 500 ml in vetro e aggiungere 10 ml di terreno dissezione ghiacciata per cervello di ratto. Agitare delicatamente il pallone mentre l'aggiunta di 1 ml di soluzione di tripsina in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) (5 mg / ml di tripsina) in 9 ml di HBSS per cervello di ratto. Aggiungere 2% Del volume totale in soluzione DNasi I (1 mg / ml) e 2% del volume totale di MgSO 4 soluzione (3,82% MgSO 4 in HBSS (w / v)) alla sospensione tessuto cerebrale e miscelare delicatamente. Trypsinize tessuto sotto blanda agitazione su un agitatore a rotazione per 30 minuti a 37 ° C. Assicurarsi che i pezzi di tessuto sono galleggianti in questa fase e non sedimentare sul fondo. Aumentare la velocità di rotazione, se necessario. Aggiungere siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale del 10% (v / v) e miscelare agitando la muffola 10 volte per 10 sec. Raffreddare la sospensione dei tessuti in acqua ghiacciata per 15 minuti. Swirl boccetta delicatamente per cinque volte ogni secondo min. trasferire delicatamente la sospensione dei tessuti in sterili provette da 50 ml con 25 ml o 50 ml pipette e centrifugare per 5 minuti a 200 xg, 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente tessuto del SNC digerito in 15 ml di mezzo di dissezione ghiacciata supplementato con 5 ml di siero fetale bovino, 0,4 ml MgSO 4 soluzione (3,82%MgSO 4 in HBSS) e 1,6 ml di DNasi I (1 mg / ml). sospensione tessuto diviso equamente in due sterili provette da 15 ml (~ 10 ml ciascuna) e lentamente triturare con una pipetta 10 ml (10 volte) fino a quando la sospensione diventa torbida / lattiginosa. Mantenere cellule sospese in ghiaccio durante l'elaborazione del tubo successivo. Attendere 3 min fino restante digerito CNS tessuti sedimenti sul fondo della provetta. Trasferire il surnatante per pulire tubo da 50 ml senza disturbare la frazione pellet. Opzionalmente, passare surnatanti torbidi attraverso il filtro delle cellule di 40 micron e combinare la conseguente sospensione cellulare unico in sterili provette da 50 ml su ghiaccio. Spin liquami cella per 5 minuti a 200 xg, 4 ° C. Rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta 10 ml fino ~ 2 ml di dissezione medie rimangono sopra il pellet cellulare. Finger pellet cellulari flick in provette da 50 ml (~ 10 volte). Lentamente aggiungere 5 ml di terreno di coltura caldo (vedi Tabella 1) alla sospensione cellulare mentre delicatamentemano agitando il tubo. Facoltativamente, ripetere DNase passo 4.3.12 per altri 10 min in ghiaccio con una soluzione di DNasi I fresca e MgSO 4 -solution in caso di cluster di tessuto visibili o grumi di DNA. tubo turbinio manualmente 5 volte al secondo min. Piastra 50.000 cellule per vetrino di vetro di 25 mm di una pozza di 400 microlitri terreno di coltura in un piatto 6-bene e lasciare le cellule attaccano per 30 minuti in un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 37 ° C). Per confluenti (entro 24 – 48 ore dopo la placcatura) piatti di coltura cellulare di 60 mm e 75 cm 2 di tessuto cultura palloni, piastra di 500.000 cellule (60 mm) o piatto 2 milioni di cellule (75 cm 2 palloni). Delicatamente aggiungere 2 ml (per bene, vetrini 25 mm in 6-ben piatto), 3 ml (piatti 60 mm) o 10 ml (75 cm 2 flaconi) del mezzo di crescita caldo a ogni pozzetto. Incubare le cellule durante la notte e cambiare media completamente la mattina seguente. Poi cambiare mezzo di ogni altro giorno (giorno 3, 5, dal 7, ecc). NoTE: Rat culture glia misto sono pronti per l'uso per immunocitochimica o biochimica 24-48 ore dopo la placcatura. Culture del mouse misto gliali Identica alla dissezione del cervello di ratto neonatale descritti nelle sezioni 4.3.1 a 4.3.6, decapitare neonatali topi WT P0 e NCAM KO con C57 / BL6 sfondo, rimuovere i cervelli e metterli in media dissezione ghiacciata (vedi Tabella 1). Mantenere tessuto su ghiaccio in ogni momento. Dividere il cervello lungo la linea mediana in due emisferi cerebrali e successivamente tagliare bulbi olfattivi, gangli della base al di sotto della corteccia cerebrale e nell'ippocampo con una pinza Dumont. Posizionare il isolato corteccia cerebrale in un piatto pulito Petri contenente HBSS sul ghiaccio. Prendete una corteccia. Rimuovere le meningi con una pinza con punte sottili al microscopio dissezione. Ripetere con gli altri cortecce. Mettere tutte le cortecce-meningi libere in uno pulito capsula di Petri sul ghiaccio. Trasferimento hemisphe corticaleres con 1 ml pipetta da ogni mouse in separate, sterili provette da 15 ml. Aggiungere 1,2 ml di mezzo di dissezione ghiacciata per ogni cervello e distruggere meccanicamente il tessuto cerebrale pipettando 2 volte su e giù con una punta della pipetta 1 ml. Aggiungere 150 microlitri soluzione papaina (10 mg / ml in PBS), 100 microlitri DNasi soluzione (1 mg / ml in HBSS) e 50 microlitri MgSO 4 (3,82% in HBSS) per ciascun cervello e mescolare muovendo dito. Incubare la sospensione del cervello per 30 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua e mescolare sospensioni cervello ogni secondo minuto da sfogliando dito. Aggiungere 1 ml di FBS per provetta, mescolare e raffreddare la sospensione di tessuto per 10 min in ghiaccio. Spin giù il tessuto cerebrale per 4 min a 200 xg, 4 ° C e risospendere il precipitato di tessuto in 1 ml di tampone dissezione ghiacciato integrati con 70 ml di I soluzione di DNasi (1 mg / ml in HBSS) e 30 ml MgSO 4 soluzione (3,82% in HBSS). Triturare il tessuto cerebrale utilizzando un FBS rivestite punta della pipetta 1 ml(~ 5 volte) fino a quando il surnatante diventa torbido. Passare il surnatante attraverso un colino cella di 40 micron e trasferire in una provetta pulita sul ghiaccio. Agglomerare cellule gliali miste attraverso centrifugazione per 5 minuti a 200 xg, 4 ° C. Aspirare il surnatante fino ~ 100 pl di mezzo sono lasciati sopra il pellet cellulare. Risospendere cellule pellet con le dita sfogliando (~ 5 volte) e aggiungere 1 ml di terreno di coltura del mouse caldo (vedi tabella 1). Opzionalmente, sciogliere gruppi di cellule visibili e cellule lisate / precipitato DNA pipettando delicatamente la sospensione cellulare su e giù (cinque volte). topo piatto misto cellule gliali su vetrini PDL rivestite o piatti da 60 mm, come descritto nei punti 4.3.19 – 4.3.21. Lavare le cellule la mattina seguente con mezzo di crescita del mouse caldo e successivamente ogni due giorni. Mouse glia misto è pronto per l'uso per immunocitochimica 48-72 ore dopo la placcatura. Isolamento Rat Microglia Cultura ratto mescolatoglia a 75 cm 2 di tessuto cultura palloni in mezzo di crescita (vedi tabella 1) per 10 giorni. Scrollarsi di dosso gruppi di cellule microgliali di culture gliali miste su un agitatore di rotazione all'interno di un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 37 ° C) a 140 giri al minuto per 1 ora. Togliere il surnatante microglia contenenti da culture glia miste, passarlo attraverso un colino cella di 40 micron e mantenere la sospensione cellulare in sterili provette da 50 ml. Nota: le culture microgliali sono tipicamente> 95% puro dopo questo passaggio con qualche OPC contaminanti e pochissimi astrociti. Opzionalmente, sostituire terreno di crescita su colture gliali miste per i futuri shake-off della microglia. Tipicamente eseguire multipli shake-off della microglia (una volta alla settimana) da colture gliali miste. Facoltativamente, per ottenere purezze superiori piastra 95% 10 ml del surnatante microglia contenente (fase 4.5.2) per 100 mm piastre di Petri e incubare in un incubatore di coltura cellulare per 30 minuti a 37 ° C. solo microglia attribuirà a piastre di Petri, mentre astrociti e OPC rimangono nel surnatante. Agitare delicatamente piastre di Petri in senso orario e antiorario (cinque volte ciascuno) nel cofano coltura cellulare. Aspirare mezzo di coltura cellulare completamente e sostituire con 10 ml di mezzo di crescita. Risultanti culture microglia sono> 98%. Cultura microglia per un massimo di 7 giorni in DMEM integrato con 1% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. Rat OPC / Isolamento degli oligodendrociti Per ottenere colture OPC altamente arricchito scrollarsi di dosso cellule microgliali primo da vecchie culture gliali miste 10 giorni coltivate in 75 cm 2 palloni su un agitatore di rotazione all'interno di un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 37 ° C) a 140 giri al minuto per 1 ora. Scartare microglia solo contenenti surnatante o utilizzare per esperimenti specifici microglia (vedi punto 5.5). Sostituire il surnatante microglial contenente con mezzo di crescita 10 ml e scrollarsi di dosso le culture gliali miste perun altro 18 ore su un agitatore di rotazione a 200 giri al minuto (5% di CO 2, 37 ° C). Raccogliere il microglia- e surnatante OPC contenenti da culture glia miste e passare attraverso un colino cella di 40 micron. Raccogliere la sospensione cellulare in sterili provette da 50 ml. Opzionalmente, sostituire terreno di crescita su colture gliali miste per i futuri OPC shake-off. Nota: OPC continuano a proliferare in strati di alimentazione astrocitari e possono essere agitati-off una seconda e terza volta (una volta alla settimana), anche se con rese inferiori. Piastra 10 ml di microglia- e OPC contenenti surnatante in 100 mm piastre di Petri e incubare in coltura incubatore cellulare per 30 minuti a 37 ° C. La microglia attribuirà alle piastre di Petri, mentre OPC e astrociti rimangono nel surnatante. Agitare delicatamente piastre di Petri in senso orario e antiorario (5 volte ciascuno) in una cappa di coltura cellulare. Estrarre solo un paio di piastre di Petri in un momento da colture cellulari incubatore (microglia inizieranno sloggiare da Petpiatti ri quando scosso vigorosamente in media più fresco). Raccogliere e combinare il surnatante OPC-contenente, in provette da 50 ml. Facoltativamente, aggiungere terreno di coltura per piastre di Petri per l'uso negli esperimenti specifici microglia. Facoltativamente, per aumentare ulteriormente la purezza delle culture OPC ripetere i punti 5.6.5 e 5.6.6 una volta con piatti freschi Petri per abbassare il punto di microglia in preparati OPC. Spin down arricchito surnatante OPC contenenti in centrifuga per 5 minuti a 250 xg, 4 ° C. Aspirare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet. Lasciare 3 ml del supernatante sopra il pellet e risospendere iniziare OPC sfogliando dito (10 volte). Delicatamente Triturare gruppi di cellule OPC utilizzando una pipetta 10 ml (5 – 10 volte). Contare le celle e piastra 50.000 OPC per 25 vetrino di vetro mm (PDL-rivestita) in una pozza di terreno di coltura 400 ml in un piatto da 6 pozzetti e lasciate cellule attaccano per 30 minuti in un incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2, 376; C). Delicatamente aggiungere 2 ml di terreno di proliferazione caldo (vedi Tabella 1) in ogni pozzetto. Per PDL rivestite da 60 mm piatti di coltura cellulare, piatto 1 – 1,5 milioni di OPC in 3 ml di terreno di proliferazione. sostituire con attenzione FBS contenente medio proliferazione con il mezzo proliferazione fresco 3 ore dopo la placcatura le OPC (assicurarsi che OPC collegati correttamente e non sloggiare durante media cambia). fluido di scambio ogni secondo giorno. Nota: culture Rat OPC preparate utilizzando questo protocollo sono in genere puro al 90% con la microglia come il tipo di cellula contaminante principale, seguito da astrociti. 5. Immunocitochimica Utilizzando HIgM12 in cellule primarie gliali Immunofluorescenza Triple-etichetta con HIgM12, anti-PSA mAb, e il tipo di cellule marcatori specifici in cellule primarie gliali da WT e NCAM KO Mice In condizioni di cellule vive, etichetta il 60% del mouse confluenti mescolato culture glia da topi WT e KO NCAM coltivate su PDL-rivestita25 coprioggetto mm vetro con HIgM12 (10 ug / ml) e anti-PSA mAb (clone 2-2B) (10 mg / ml) in PBS supplementato con 10% FBS a 4 ° C per 30 min. Lavare le cellule tre volte per 20 secondi ciascuno con PBS freddo supplementato con 10% FBS e fissare con 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4 per 15 minuti a 25 ° C. Lavare le cellule fissate due volte per 1 min ciascuno con PBS supplementato con 10% FBS e permeabilize cellule con 0,1% Triton-X100 in PBS, pH 7,4 per 2 minuti a 25 ° C. Lavare le cellule due volte per 1 min e l'etichetta con marcatori gliali GFAP (astrociti) o IBA-1 (microglia) (1 mg / ml) in PBS supplementato con 10% FBS notte a 4 ° C in cella. Procedere con condizioni di immunofluorescenza standard, tra cui media 31 montaggio DAPI contenenti. Nota: l'uso di fluorescente Fab 2 frammenti come anticorpi secondari per l'uomo (HIgM12) e del mouse (anti-PSA monoclonale, clone 2 – 2B) IgM è fortemente raccomandato. prendere flimmagini uorescenti a 60X o di ingrandimento 100X. Utilizzare le stesse impostazioni dello strumento per tutte le immagini e le immagini di processo in modo identico. Immunofluorescenza Etichettatura di endo-NF-trattati cellule WT Glia utilizzando HIgM12 come un anticorpo primario Cultura WT del mouse glia mescolato alla produzione di 3 giorni in Neurobasal Un integrato con il 10% FBS e supplemento B27 (1:50) su PDL rivestite coprioggetto 25 mm di vetro. Aggiungere ENDO-NF (30 ug / ml) di mezzo di coltura 1 ml e incubare durante la notte in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2). cellule Label vivono nel freddo con HIgM12 e interna GFAP marcatore astrociti dopo la fissazione e permeabilizzazione come descritto nei punti da 5.1.1 a 5.1.5. Prendere immagini fluorescenti a 60X o di ingrandimento 100X. Utilizzare le stesse impostazioni dello strumento per tutte le immagini ed elaborare in modo identico.