JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

ספציפי כריכת נוגדן עבור קאפה (Vκ) שרשרת המכילה באור אנושי (IgM) נוגדנים: Polysialic החומצה (PSA) מצורפים NCAM כמקרה מבחן

Published: June 29, 2016
doi:
10.3791/54139
, , , , , ,
1Department of Neurology,Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Center for Multiple Sclerosis and Autoimmune Neurology,Mayo Clinic, 3Center for Regenerative Medicine, Neuroregeneration,Mayo Clinic, 4Division of Neonatal Medicine,Mayo Clinic, 5Department of Pediatric and Adolescent Medicine,Mayo Clinic

Summary

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

Abstract

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.

This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

Introduction

נוגדנים של אלוטיפ IgM להפגין פוטנציאל טיפולי רב לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן והפרעות במערכת העצבים המרכזית 1-7. הקבוצה 'Vollmers זיהתה נוגדנים רבים בקרב חולי סרטן לשימוש פוטנציאל לשמש כסמנים ביולוגיים או רפוי פעיל-גידולים ספציפיים המסוגלים להרוג תאים ממאירים על ידי גרימת מסלולי אפופטוטיים 4,8,9. המעניין לשים לב שכל הנוגדנים המזוהים עם פוטנציאל טיפולי הם של אלוטיפ IgM ולהשתייך לקבוצה "נוגדנים עצמיים טבעיים" (חטיף).

בדומה לכך, הקבוצה של רודריגז מזוהה עכבר נוגדנים אנושיים המעודדים מיאלין מחדש בנגעי חוט שדרת demyelinated הכרוני במודלים של טרשת נפוצה (MS). זהה נוגדנים עם השפעות נוגדות סרטן, כל הנוגדנים לקידום מיאלין מחדש הם nabs ושל אלוטיפ IgM 1,6,7,10. אנטיגנים המדויק IgMs המזוהה ביותר עדיין undetermineד כולל נוגדן אנושי לקידום מיאלין מחדש rHIgM22, כרגע בשלב הראשון של הניסויים הקליניים של חולים בטרשת נפוצה 11. למרות מאמצים חוזרים ונשנים על ידי מומחים בתחום של מחקר שומנים פחמימות הן את ההגדרה האקדמית בשיתוף עם התעשייה 11, מנסה לזהות אנטיגן של rHIgM22 לא הוכתרו בהצלחה. הכישלון של טכניקות סטנדרטיות המשמשות לזיהוי אנטיגנים של נוגדני IgG לעבוד עם נוגדני IgM מזהה צורך קריטי כדי לחדד שיטות ספציפיות נוגדנים אלה כי היעד הסביר ביותר אנטיגנים פחמימות או שומנים.

ההתמקדות של כתב היד הזה היא נוגדן משובי אדם HIgM12 ואת הפרוצדורות המשמשות לזיהוי אנטיגן שלה. נוגדן HIgM12 זוהה מחולים עם macroglobulinemia של Waldenstrom, מגרה תולדה neurite במבחנה 12-14 וממקד חומצה polysialic (PSA) מחוברת מולקולת הידבקות התא העצבי (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 ומאריכה את תוחלת חיים במודל של עכברים של ALS 17 ומשפרת תוצאה תפקודית בנגיף encephalomyelitis בעכברים של Theiler (TMEV) עכברי -infected. באופן ספציפי, HIgM12 מגרה פעילות מוטורית אופקית ואנכית ספונטנית demyelinated כרוני מספרי עכברים ועליות של אקסונים בחוט השדרה בקוטר קטן ובינוני שמונה שבועות לאחר מנה אחת, נמוכה של intraperitoneal מוזרקת נוגדן 18.

מולקולת הידבקות תא העצבית (NCAM) היא גליקופרוטאין של אימונוגלובולינים (איג) הביעו superfamily על פני התא של הנוירונים, גליה, שרירי שלד, תאי הרג טבעי 19-25. השלושה isoforms NCAM הגדול כינת NCAM180, NCAM140, ו NCAM120, הם וריאנטים אחוי חלופה של תמליל עיקרי להשתנות רק בתחום ציטופלסמית שלהם. בתוך מערכת העצבים המרכזית, NCAM היא מולקולת polysialylated הגדולות (> 95%) עם ארוך, homopolymers חומצה sialic טעונים שלילית. PolysialicCID עם n> 10 נקרא PSA אבל מבני oligomeric קצרים קיימים כי הם גם ביולוגיים רלוונטיים. חלבונים polysialylated אחרים הביעו במערכת העצבים המרכזית הם SynCAM1 26, Neuropilin-2 (מפד"ל-2) 27,28 ו למקטע ערוץ נתרן 25 (לסקירה ראה 29).

השיטות שתוארו כאן ניתן לזהות אנטיגן עבור אימונוגלובולינים האדם והעכבר המכיל ספציפי קאפה (Vκ) שרשראות אור (VκI, VκIII או VκIV שרשראות אור עבור נוגדנים אנושיים ורשתות אור VκI נוגדנים העכבר) אינו מותנה של אלוטיפ של נוגדן (למשל, IgG, IgM , IgA, IGD או IgE). מגבלה זו מבוססת על שימוש של agarose L חלבון עבור immunoprecipitations עם נוגדנים של אלוטיפ IgM. אסטרטגיות חלופיות יכולות לכלול לקטינים מחייב מנוז ונוגדנים אנטי-IgM IgG משני קשור קוולנטית agarose חרוזים, אשר עשוי להרחיב את תחולת בשיטה זו כדי נוגדנים יותר IgM including אלה עם למבדה (λ) שרשראות אור (ראה דיון). יחסי חלק מרשתות אור בסרום IgM Vκ לעומת שרשראות אור λ IgM נגזר אנשים בריאים הם 1.5: 1 30.

בהתבסס על המתודולוגיה chromatographic משמשת כאן כדי להפריד, להעשיר אימונולוגית לזהות מולקולות מסוימות 31, כל אנטיגנים נדרשים לכלול לפחות תחום חלבון קטן אחד. את epitope מחייב הספציפי של הנוגדן יכול להיות בתוך או מחוץ לתחום החלבון (לדוגמא, ב גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים). צעדים ביוכימיים ראשוני המשמש לזיהוי אנטיגן ספציפי עבור HIgM12, בהתאמה כדי לצמצם את רשימת המועמדים הפוטנציאליים, הם הצעדים החשובים ביותר בשיטה זו. סוג תא הכנות ספציפיות אפיונים מבוססי תאי מורפולוגיה מתוארות ביחס ותאי גלייה אבל מתודולוגיה זו ניתן להסיק על להכיל סוגי תאים אחרים בתוך או מחוץ למערכת העצבים המרכזית.

ישן דחוףצריך לפתח טכניקות חדשות או שונות ישימות עבור המספר הולך וגדל של נוגדני IgM עם פוטנציאל טיפולי להפרעות אנושיות שונות במיוחד באותם מקרים (רוב אנטיגנים IgM) שבו הנוגדן המכוון הם מבני פחמימות או שומנים.

Protocol

פרוטוקולים ונהלים בעלי חיים בוצעו בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות אושרו על ידי הוועדה לטיפול ולשימוש בבעלי חיים המוסדית של Mayo Clinic (מספר פרוטוקול מאיו IACUC # A51912). 1. הכנת רקמות הכללית CNS צור לקוי NCAM (KO) עכברים על רקע C57 / BL6 (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר לין Landmesser, אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב, קליבלנד, אוהיו), עכברים NCAM הטרוזיגוטיים וסוג בר (WT) להמלטה (C57 / BL6) על ידי חציית heterozygotes. Genotyping של עכברי NCAM KO תואר בעבר 32-34 ולא יהיה סביר בפירוט נוסף. הערה: שלבי 1.2 – 1.6 הם אופציונליים. לפני הניתוח, לנהל פתרון pentobarbital (במלאי: 25 מ"ג / מ"ל; 50/100 μl של pentobarbital לשלבים בוגרים בהתאמה לאחר הלידה המוקדמת) באמצעות זריקה intraperitoneal (מחט מד 27 ו 1 מ"למַזרֵק). חכה 2 דקות או עד שהחיה הגיע במטוס כירורגית של הרדמה. נהל הרדמה נוספת לפי צורך במהלך כל פעולה כדי לשמור על מטוס של הרדמה כירורגית. השתמש בשיטת בוהן קמצוץ-בתגובה לקבוע עומק ההרדמה. בעלי החיים חייבים להיות מגיבים לפני שתמשיך. הכן 0.5 – חתך לרוחב 1 ס"מ דרך integument ואת דופן הבטן ממש מתחת לצלעות. בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת. ביצוע חתך קטן הסרעפת באמצעות מספריים מעוקלים, בוטים. המשך החתך הסרעפת לאורך כל אורכו של בית החזה כדי לחשוף את חלל פלאורלי. מניחים מעוקל, מספריים קהים לאורך צד אחד של כלוב הצלעות, דחקו את הריאות בזהירות, ולעשות חתך דרך עד לצלעות על עצם הבריח. ביצוע חתך דומה בצד הנגדי. הרמת החזה משם, בזהירות לקצץ את כל רקמת חיבור זה ללב. עושים חתך לבעל החיים'S עלייה ימנית באמצעות מספרי איריס ליצור כמו גדול לשקע ככל האפשר. לאט לאט להזריק 10 מ"ל של בופר פוספט (PBS) לתוך החדר השמאלי של בעל החיים (אור אדום; קצב הזרימה: 1 מ"ל / דקה) באמצעות מזרק 10 מ"ל מצויד במחט 27-מד. אין להגדיל את זרימת לחץ / PBS במהלך זלוף כדי למנוע הרס רקמות. לערוף עכברים בילוד באמצעות מספריים כירורגיות. הסר את המוח על ידי גרירה של ארובות עיניים עם מלקחיים על ידי החדרת מספריים קטנים לתוך עמוד השדרה. חותכים את הגולגולת לכיוון חזית בגובה האוזניים. לקלף בחזרה את הגולגולת ומניחים בעדינות את המוח לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח על הקרח (טבלה 1). מניחים כל המוח בתוך שפופרת microcentrifuge 1.5 מ"ל ומיד לאחסן על קרח יבש (-79 ºC). לחתוך את גזע המוח הקטן והמוח מן המוח הקפוא באמצעות סכין גילוח נקי על קרח. לעבוד במהירות כדי למנוע הפשרת הרקמה. לשקול אתהמוח הגדול קפוא, להכניס צינור 15 מ"ל על קרח להוסיף למאגר תמוגה קר כקרח (ראו טבלה 1) לריכוז סופי של 150 מיקרוגרם ברקמת המוח לכל מאגר μl תמוגה. חזור על הפעולה עבור הנותרים cerebra. שומר את המוח על קרח בכל העת לצעדים 1.9 – 1.11. Homogenize המוח חיץ תמוגה על ידי טחינה דקה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל (10 פעמים) ואחריו טחינה דקה באמצעות מזרק 5 מ"ל מצויד במחט 27-מד (10 פעמים). דגירה lysates המוח למשך 30 דקות נוספות על הקרח כדי לאפשר תמוגה רקמה שלמה. הסר שומנים חומר דטרגנט-מסיס והמוח דרך צנטריפוגה סדרתי (ארבעה סיבובים 19,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C). מחק (לבנה) המיאלין ופסולת תא המכילה גלולה, אך נשמר supernatant אחרי כל צעד צנטריפוגה. lysates המוח Aliquot ולאחסן ב -80 ºC. 2. Immunoprecipitations שימוש אדם IgMs (HIgM12 ו isotype שליטת IgM) בתור סוכן "נפתח" מ Cerebral Lysates של WT ו NCAM KO עכברים L חלבון Agarose ביד הכנה 9,35,36 הכן 200 מ"ל של חיץ IP כולל BSA (ראו טבלה 1). הכן עוד 200 מ"ל של חיץ אותו IP ללא BSA. לכל העברה התגובה immunoprecipitation 100 μl של slurry חלבון L Agarose בעזרת פיפטה 200 μl לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. האם לא חרוזים agarose מערבולת חלבון L! הוסף 1 מ"ל של חיץ IP (ראו טבלה 1) על צינור אחד. מערבבים חלבון agarose L חיץ IP באופן ידני באמצעות היפוך (חמש פעמים). חרוזים agarose חלבון L לשטוף ארבע פעמים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה benchtop (1,000 XG, 2 דקות, 25 ºC). תוריד supernatant בעזרת פיפטה 200 μl מבלי להפריע גלולה agarose. שטיפה חוזר על שלבי 2.1.2 עד 2.1.3 שלוש פעמים נוספות. לאזן agarose L חלבון ב 1 מ"ל של חיץ IP הוסיף טרי על מכבש לילה ב 4 מעלות צלזיוס. גיבוש הרכב נוגדן-אנטיגן-Agarose L וזיהוי Antigen ב כתמים מערביים דגירה 30 מ"ג של רקמת המוח lysed (~ 200 lysate μl) ב 1 מ"ל של חיץ IP קר כקרח עם 20 מיקרוגרם של נוגדנים IgM (HIgM12) בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל לילה על מכבש ב 4 ºC. ספין למטה חרוזים חלבון L agarose (משלב 2.1.4) בצנטריפוגה benchtop למשך 2 דקות XG ב 1000, 4 ºC. בטל supernatant בעזרת פיפטה 200 μl מבלי להפריע גלולה agarose. מוסיפים את פתרון lysate נוגדן-המוח צונן (משלב 2.2.1) אל agarose חלבון L בעזרת פיפטה 1 מ"ל. לדגור על השעיית agarose נוגדן-אנטיגן חלבון L עבור שעה 2 על מכבש ב 4 ºC. שטוף את הרכב הנוגדן-אנטיגן המצורף agarose L באמצעות צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 2 דקות, 4 ºC. בזהירות להתעלמות supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ IP קר כקרח המכיל 0.2% BSA. חזור על שלב הכביסה עוד פעם אחת באמצעות חיץ IP קר כקרח המכיל BSA 0.2% ושתי פעמים נוספות באמצעות חיץ IP קר כקרח ללא BSA. ספין למטה הרכב נוגדן-אנטיגן המצורף agarose L XG ב 1000 למשך 2 דקות, 4 ºC. בטל supernatant לחלוטין ראשון בעזרת פיפטה 200 μl עד ~ 50 μl של פתרון נותרים על גבי גלולת agarose חלבון L ואחריו פיפטה 10 μl. שמור על דגימות קרח. הוסף 40 μl של חיץ elution IP (ראה טבלה 1) לכל 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, צינורות קפיצים אצבע 6 פעמים וחומות במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. שימו דגימות קרח למשך 2 דקות ו ספין למטה במשך 30 שניות 13,000 XG, 4 ºC. העברת supernatant בעזרת פיפטה 10 μl (~ 35 סך μl) לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי מבלי להפריע הגלולה. אשר בהעדר חרוזים agarose חלבון L ידי שטיפה למטה כמות קטנה של המדגם eluted בכותל אבוב. הערה: "גרגירים"חרוזי חלבון L agarose גלויים לעין אם הוא קיים. אם חרוזים agarose חלבון L נוכחים, ספין למטה מדגם למשך 30 שניות ב -13,000 XG ולהעביר supernatant לנקות צינור. חזור על שלב עד אין חרוזי agarose ניתנים לזיהוי. טען 10 – 20 μl של דגימות eluted לכל טוב על ג'ל SDS-polyacrylamide במערכת חיץ טריס / גליצין / SDS (ראו טבלה 1). הערה: השתמש 7.5% או 4 – 20% ג'ל שיפוע עם נפח העמסה 50 μl לכל טוב לצורך זיהוי של PSA-NCAM או isoforms NCAM (מידות ג'ל (עובי x L x W: 8.6 x 6.7 x 0.1 ס"מ). ג'ל לרוץ ~ 1 שעות ב -100 V (1.74 V / 2 ס"מ) על benchtop. קירור נוסף אינו נדרש בשלב זה 37,38. חלבוני העברת PVDF (פלואוריד polyvinylidene) קרום (הגודל נקבובי 0.45 מיקרומטר) עבור 2.5 שעות בחדר הקר ב -100 V (1.74 V / 2 סנטימטר) באמצעות חיץ העברה קר (5 – 10 ºC) (ראה טבלה 1). ממברנות חסומות wה- i 10% (w / v) אבקת חלב יבש ב PBS-T עבור שעה 1 ב 25 ºC על שייקר המעבדתיים מסלולית, לשטוף ממברנות פעמיים במשך 10 דקות עם PBS-T ו- החללית לילה עם הנוגדן העיקרי BSA 5% PBS- T על שייקר מסלולית בחדר הקר. השעה אחת ממברנות לשטוף למחרת בבוקר בקצרה עם עודף PBS-T ב -25 ºC (כולל מכסה מיכל) ואחריו 3 שוטף עם PBS-T במשך 10 דקות כל אחד על שייקר מסלולית (80 סל"ד) (כל שלבי הכביסה מתבצעים בבית 25 ºC). הוספת נוגדנים משני (peroxidase חזרת (HRP), מצומדות אנטי אנושי נוגדנים נגד IgM (עבור HIgM12) (דילול 1: 30,000) ב 5% אבקת חלב יבש ב PBS-T עבור 1 שעות בשעה 25 ºC על שייקר מסלולית (70 סל"ד ). ממברנות לשטוף בהרחבה פעם אחת בקצרה עם עודף PBS-T ב -25 ºC (כולל מכסה מיכל) ואחריו 3 שוטף עם PBS-T במשך 10 דקות כל אחד על שייקר מסלולית (80 סל"ד) (כל שלבי הכביסה מבוצעים במהירות של 25 ºC) . מערבבים 1 מ"ל של chemiluminescen משופרת מצונןרכיב המצע ce HRP (מגיב לומינול משופר) עם 1 מ"ל של B רכיב (מגיב חמצון) (מחיר כתם מיני) ב 25 ºC. שימוש במלקחיים פלסטיק להעביר את הקרום על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים (להחזיק אותם בקצוות מאוד). מכולות יבשות עם מגבות נייר ממברנות לשים בחזרה המכולות (אחד לכל ממברנה). מיד להוסיף 2 מ"ל של המצע HRP chemiluminescence משופרת טרום מעורבת (מתחם A + B) (שלב 2.2.16.) לכל הממברנה דגירה במשך 2 דקות ב 25 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (90 סל"ד). הפכו ממברנות בטוח הם טבולה אחידה על ידי הגיב chemiluminescence. העברת ממברנות לתוך שרוול פלסטיק שקוף להסיר בועות נוזל ואוויר עודפות במגבות נייר. שים ממברנות בשרוול פלסטיק קלטת סרט ובסופו של דבר ידביק את שרוול הפלסטיק לתוך הקלטת. סגור את הקלטת. קח את הקלטת, סרט, טיימר ומספריים לתוך החושך. חותכים בפינה הימנית העליונה מכל fiLM למטרות אורינטציה, לחשוף סרטים (שונים) לתקופות זמן שונות (10 שניות, 1 דקות, 10 דקות) ולפתח סרטי מפתח בסרט. 3. Endoneuraminidase-NF עיכול של PSA מצורף NCAM 39 תקציר lysed המוח רקמות מיום הלידה (P) 7 עכברים WT ו P7 NCAM KO עכברים (שהוכן צעד 1.12) עבור 2 שעות על הקרח באמצעות endoneuraminidase-NF (Endo-NF) כפי שמודגם בטבלה 2 39. הוסף 5 μl של חיץ מדגם 4x Laemmli על צינור אחד (1 – 6) משלב 3.1 (טבלה 2). דגימות טענו על 4 – ג'ל SDS-polyacrylamide שיפוע 20% וחזרו על שלבי 2.2.10 עד 2.2.19. ממברנות Probe עם HIgM12 (1 מיקרוגרם / מ"ל), זמינים מסחרית מב אנטי PSA (שיבוט 2-2B) (1 מיקרוגרם / מ"ל) ו β-אקטין נוגדן (טעינה מלאה) (1 מיקרוגרם / מ"ל) BSA 5% ב PBS -T. 4. הכנת עכברוש ותרבויות עכבר CNS <strong> הכנת זכוכית Coverslips coverslips זכוכית חומצה לשטוף 25 מ"מ 1 M HCl ב 50 – 60 ºC 4 – 16 שעות במנדף באמצעות מיכל זכוכית. להתסיס coverslips לעיתים דרך מתערבל עדין. לשטוף כוס coverslips בהרחבה במים מזוקקים (3x). הקפד לשטוף את החומצה בין coverslips המוערם. יש לשטוף coverslips באתנול 100% ולייבש אותם על Parafilm במנדף תרבית תאים. יום אחד לפני השימוש, לחמם את coverslips זכוכית למשך 24 שעות במיכל זכוכית עם מכסה ב -100 ºC בתנור. שים coverslips זכוכית בצלחת 6-היטב מעיל עם 3 מ"ל של 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי- D- ליזין במים סטריליים עבור שעה 1 ב 37 ºC. פעמיים לשטוף עם מים סטריליים, להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע תרבית תאים ולהחיל אור UV במשך 20 דקות. הכנת פלסטיק בתרבית רקמה תאים CNS מעיל 60 מ"מ צלחות תרבית תאים או 75 ס"מ 2 רקמות התרבות צלוחיות עם 3מ"ל מ"ל או 10, בהתאמה, של 40 מיקרוגרם / פולי-D- ליזין מ"ל מים סטריליים עבור שעה 1 ב 37 ºC. שטפו פעמיים עם מים, להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע תרבית תאים ולהחיל אור UV במשך 20 דקות. מעורבב עכברוש בידוד גליה 40 להרדים חולדות ילודות ב IACUC אושר קאמרי המתת חסד מכרסמת עם תחילת אספקה ​​2 CO (מלא automatized). השתמש בשיטת בוהן קמצוץ-בתגובה לקבוע את בעיית חוסר התגובה של החיה. לערוף עכברוש ספראג Dawley בילוד (P0P1) (6 – 10 גורים בכל פעם). הסר את המוח על ידי גרירה של ארובות עיניים עם מלקחיים על ידי החדרת מספריים קטנים לתוך עמוד השדרה. חותכים את הגולגולת לכיוון חזית בגובה האוזניים. לקלף בחזרה את הגולגולת ומניחים בעדינות את המוח לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ מלא 10 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח על הקרח (ראו טבלה 1). חזור על הפעולה עבור הנותרים גורי חולדה (6 – 10 גורים). שמור רקמות על קרח למשך צעדים 4.3.2 – 4.3.7. </li> מחלקים את המוח הגדול לאורך קו האמצע לשתי אונות המוח ובהמשך לנתק נורות חוש הריח, הגרעינים הבזליים מתחת קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס עם מלקחיים דומון. מניח את קליפת המוח המבודדת בצלחת פטרי המכילה נקיה לנתח בינוני על קרח. קח קליפה אחד. הסר את קרומי המוח עם מלקחיים עם עצות קנס תחת מיקרוסקופ לנתיחה. חזור עם הקורטקס הנותר. מניחים את כל הקורטקס ללא קרומי המוח לתוך אחד צלחת נקייה פטרי על הקרח. שלב ההמיספרות קליפת המוח מכל הגורים בצלחת פטרי 60 מ"מ ולהשתמש סכין גילוח סטרילי לקוביות רקמת המוח לתוך 1 מ"מ טחון חתיכות. מעבירים את רקמת המוח טחון בעזרת פיפטה 10 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית סטרילית, ללא ציפוי 500 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח לכל המוח עכברוש. מערבולת בעדינות את הבקבוק תוך הוספת 1 מ"ל של תמיסת טריפסין ב HBSS (תמיסת מלח מאוזן של האנק) (5 מ"ג / מ"ל ​​טריפסין) עד 9 מ"ל של HBSS לכל המוח עכברוש. מוסיפים 2% מהנפח הכולל בתמיסה DNase אני (1 מ"ג / מ"ל) ו -2% מכלל נפח בתמיסה MgSO 4 (3.82% MgSO 4 ב HBSS (w / v)) על השעיית המוח רקמות לערבל בעדינות. Trypsinize רקמה תחת רעד עדין על שייקר סיבוב למשך 30 דקות ב 37 ºC. הפוך פיסות רקמה בטוחות צפות במהלך שלב זה ואינו משקעת לתחתית. הגדל מסתובבת במהירות במידת הצורך. להוסיף בסרום שור העובר (FBS) לריכוז סופי של 10% (v / v) ומערבבים על ידי מתערבל את הבקבוק 10 פעמים במשך 10 שניות. להתקרר השעית רקמות במי קרח למשך 15 דקות. מערבולת בקבוקון בעדינות חמש פעמים במהלך כל דקות שניות. בעדינות להעביר את ההשעיה רקמה לתוך צינורות סטרילי 50 מ"ל באמצעות 25 מ"ל או 50 מ"ל טפטפות ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200 XG, 4 ºC. בטל supernatant בעדינות resuspend מתעכל רקמת מערכת העצבים המרכזית ב 15 מ"ל של מדיום לנתח קר כקרח בתוספת 5 מ"ל של סרום שור העובר, 0.4 מ"ל פתרון MgSO 4 (3.82%MgSO 4 ב HBSS) ו -1.6 מ"ל של DNase אני (1 מ"ג / מ"ל). ההשעיה רקמות להתחלק שווה בשווה לשני צינורות סטרילי 15 מ"ל (~ 10 מ"ל כל אחד) ולאט לאט triturate בעזרת פיפטה 10 מ"ל (10 פעמים) עד ההשעיה הופך / חלבי עכור. שמור את התא מושעה על קרח בעת עיבוד הצינור הבא. חכה 3 דקות עד נותרים מתעכל CNS רקמות משקעים לתחתית של התחתית. supernatant העברת לנקות שפופרת 50 מ"ל מבלי להפריע את החלק היחסי גלולה. לחלופין, לעבור supernatants עכור דרך מסננת תא 40 מיקרון ולשלב את ההשעיה תא בודד שנוצר לתוך 50 סטרילי מ"ל הצינורות על הקרח. ספין תא סלארי במשך 5 דקות ב 200 XG, 4 ºC. הוצא בעדינות את supernatant בעזרת פיפטה 10 מ"ל עד ~ 2 מ"ל של ביתור בינוני נותרים על גבי התא גלולה. תא קפיץ אצבע כדורי ב 50 מ"ל צינורות (~ 10 פעמים). לאט לאט מוסיפים 5 מ"ל של מדיום הגידול חם (ראו טבלה 1) על השעיית התא תוך בעדינותיד מתערבלת הצינור. לחלופין, חזור על שלב DNase 4.3.12 עבור 10 דקות נוספות על קרח עם פתרון שאני DNase טרי MgSO 4 -solution במקרה של אשכולות רקמות גלויים או גושי DNA. צינור מערבולת ידני 5 פעמים בכל דקה שנייה. פלייט 50,000 תאים לכל coverslip זכוכית 25 מ"מ בתוך שלולית של מדיום גידול 400 μl בצלחת 6-היטב ולתת תאים לצרף למשך 30 דקות בתוך חממת תרבית תאים (5% CO 2, 37 ºC). לקבלת ומחוברות (בתוך 24 – 48 שעות לאחר ציפוי) 60 מ"מ בתא תרבות מנות ו -75 ס"מ 2 צלוחיות בתרבית רקמה, צלחת 500,000 תאים (60 מ"מ צלחת) או 2 מיליון תאים (75 ס"מ 2 צלוחיות). בעדינות להוסיף 2 מ"ל (מחיר טוב, 25 מ"מ זכוכית coverslips בצלחת 6-היטב), 3 מ"ל (60 מנות מ"מ) או 10 מ"ל (75 ס"מ 2 צלוחיות) של מדיום הגידול חם זה טוב. דגירת תאי הלילה ולשנות בינוני לחלוטין למחרת בבוקר. ואז לשנות בינוני בכל יום אחר (יום 3, יום 5, יום 7, וכו '). לאטה: תרבויות גליה מעורבת עכברוש מוכנות לשימוש עבור immunocytochemistry או ביוכימיה 24 – 48 שעות לאחר הציפוי. העכבר מעורב תרבויות גליה זהה דיסקציה של המוח עכברוש בילוד בסעיפים 4.3.1 עד 4.3.6, לערוף P0 בילוד WT ו NCAM KO עכברים עם C57 / BL6 רקע, להסיר את המוח ולשים אותם במדיום לנתח קר כקרח (ראו טבלה 1). שמור רקמות על קרח בכל העת. מחלקים את המוח הגדול לאורך קו האמצע לשתי אונות המוח ובהמשך לנתק נורות חוש הריח, הגרעינים הבזליים מתחת קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס עם מלקחיים דומון. מניח את קליפת המוח המבודדת בצלחת נקיה פטרי המכילה HBSS על קרח. קח קליפה אחד. הסר את קרומי המוח עם מלקחיים עם עצות קנס תחת מיקרוסקופ לנתיחה. חזור עם הקורטקס הנותר. מניחים את כל הקורטקס ללא קרומי המוח לתוך אחד צלחת נקייה פטרי על הקרח. העבר hemisphe קליפת המוחמיל עם פיפטה 1 מ"ל כל עכבר לתוך צינורות נפרדים, סטרילי 15 מ"ל. להוסיף 1.2 מ"ל בינוני לנתח קר כקרח לכל המוח מכנית לשבש את רקמת המוח על ידי pipetting זה 2 פעמים למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. להוסיף 150 פתרון פפאין μl (10 מ"ג / מ"ל PBS), 100 μl DNase לי פתרון (1 מ"ג / מ"ל ב HBSS) ו -50 μl 4 MgSO (3.82% ב HBSS) לכל המוח ומערבבים ידי מצליף אצבע. לדגור על השעיית המוח למשך 30 דקות ב 37 ºC באמבט מים ומערבבים השעיות המוח מכל רגע השני על ידי מצליף אצבע. הוסף 1 מ"ל של FBS לכל צינור, לערבב לצנן את ההשעיה רקמות במשך 10 דקות על הקרח. ספין למטה רקמת המוח במשך 4 דקות ב 200 XG, 4 ºC ו resuspend גלולה רקמת ב 1 מ"ל של חיץ לנתח קר כקרח השלימו עם 70 μl של פתרון DNase אני (1 מ"ג / מ"ל ב HBSS) ו -30 μl MgSO 4 פתרון (3.82% ב HBSS). Triturate רקמת המוח באמצעות קצה פיפטה מ"ל 1 מצופה FBS(~ 5 פעמים) עד supernatant הופך עכור. להעביר את supernatant דרך מסננת תא 40 מיקרון ולהעביר לתוך צינור נקי על קרח. גלולה ותאי גלייה מעורבים באמצעות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 XG, 4 ºC. לשאוב supernatant עד ~ 100 μl של המדיום נותרים על גבי התא גלולה. גלולה תא גלולה ידי אצבע מצליף (~ 5 פעמים) ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול העכבר חם (ראו טבלה 1). לחלופין, לפזר צבירי תאים גלויים ותאי lysed / זירז DNA על ידי pipetting למעלה ההשעיה תא בעדינות מעלה ומטה (חמש פעמים). עכבר פלייט ותאי גלייה מעורבת על coverslips זכוכית PDL מצופים או 60 מנות מ"מ כמתואר בשלבים 4.3.19 – 4.3.21. שטוף תאים למחרת בבוקר עם מדיום גידול עכבר חמים ולאחר מכן בכל יום אחר. עכבר גליה מעורבת מוכנה לשימוש עבור 48 immunocytochemistry – 72 שעות לאחר הציפוי. בידוד עכברוש Microglia עכברוש תרבות מעורבגליה צלוחיות תרבות 75 ס"מ 2 רקמות במדיום הגידול (ראו טבלה 1) במשך 10 ימים. להתנער צבירי תאי microglial מתרבויות גליה מעורבות על שייקר סיבוב בתוך תרבית תאי חממה (5% CO 2, 37 ºC) ב 140 סל"ד במשך שעה 1. תוריד את supernatant המכילים microglia מתרבויות גליה מעורבת, להעביר אותו דרך מסננת תא 40 מיקרון ולשמור ההשעיה תא צינורות סטרילי 50 מ"ל. הערה: תרבויות microglial הן בדרך כלל> 95% טהורים לאחר שלב זה עם כמה זיהום OPCs ומעטים מאוד האסטרוציטים. לחלופין, להחליף מדיום גידול על תרבויות גליה מעורבות למחיקת שייק microglial בעתיד. בדרך כלל לבצע ניעור offs microglial המרובה (פעם בשבוע) מתרבויות גליה מעורבות. לחלופין, כדי לקבל purities צלחת 95% יותר 10 מ"ל של supernatant המכילים microglia (שלב 4.5.2) לכל 100 מ"מ צלחות פטרי דגירה של תרבית תאים חממה למשך 30 דקות ב 37 ºC. רק microglIA יצרף צלחות פטרי, בעוד אסטרוציטים OPCs להישאר supernatant. נער בעדינות צלחות פטרי בכיוון השעון נגד כיוון השעון (חמש פעמים כל אחד) ב למכסה המנוע תרבית תאים. תרבית תאים בינוניים לשאוב לחלוטין ולהחליף עם 10 מ"ל של מדיום הגידול. תרבויות microglia וכתוצאה מכך הן> 98% טהורים. microglia תרבות עד 7 ימים DMEM בתוספת FBS 1% ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין. OPC עכברוש / בידוד oligodendrocyte כדי להשיג תרבויות OPC מועשר להתנער תאים microglial הראשון מ -10 תרבויות גליה מעורבת יממה שגודלו 75 ס"מ 2 צלוחיות על שייקר הסיבוב בתוך תרבית תאים חממה (5% CO 2, 37 ºC) ב 140 סל"ד במשך שעה 1. בטל microglia המכילים רק supernatant או להשתמש לניסויים ספציפיים microglia (ראה שלב 5.5). החזר את supernatant המכיל microglial עם מדיום גידול 10 מ"ל ולהתנער תרבויות גליה מעורבותעוד 18 שעות על שייקר הסיבוב בסל"ד 200 (5% CO 2, 37 ºC). אסוף את microglia- ו supernatant OPC המכיל מתרבויות גליה מעורבות ולהעביר דרך מסננת תא 40 מיקרון. אסוף את ההשעיה תא 50 סטרילי צינורות מ"ל. לחלופין, להחליף מדיום גידול על תרבויות גליה מעורבות למחיקת שייק OPC בעתיד. הערה: OPCs ממשיך להתרבות על שכבות מזין astrocytic ויכול להתערער פעמי זמן שני ושלישי (פעם בשבוע), אם כי עם תשואות נמוכות. פלייט 10 מיליליטר של microglia- ו OPC המכיל supernatant לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי דגירת תרבית תאי חממה למשך 30 דקות ב 37 ºC. Microglia יצרף צלחות פטרי, בעוד OPCs האסטרוציטים להישאר supernatant. נער בעדינות צלחות פטרי בכיוון השעון נגד כיוון השעון (5 פעמים כל אחד) במנדף תרבית תאים. להוציא רק כמה צלחות פטרי בכל פעם מן החממה תרבית תאים (מיקרוגליאה יתחיל פירוק מחיית המחמדמנות רי כאשר מטלטלים אותם נמרצות במדיום קריר). אסוף ולשלב את supernatant המכיל OPC ב 50 מ"ל צינורות. בנוסף, אפשר להוסיף בינוני תרבות צלחות פטרי לשימוש בניסויים microglia ספציפית. לחלופין, כדי להגביר עוד יותר את הטוהר של תרבויות OPC לחזור על שלבים 5.6.5 ו 5.6.6 פעם עם מנות טריות פטרי להוריד את היקף microglia בהכנות OPC. ספין למטה supernatant OPC המכילים מועשר ב צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 250 XG, 4 ºC. בעדינות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולת התא. השאירו 3 מ"ל של supernatant על גבי גלולה ולהתחיל resuspending OPCs ידי מצליף אצבע (10 פעמים). בעדינות triturate צבירי תאים OPC באמצעות פיפטה 10 מ"ל (5 – 10 פעמים). ספירת תאי צלחת 50,000 OPCs לכל 25 coverslip זכוכית מ"מ (PDL מצופה) בתוך שלולית של מדיום גידול 400 μl בצלחת 6-היטב ולתת תאים לצרף למשך 30 דקות בתוך חממת תרבית תאים (5% CO 2, 376: C). בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של מדיום הפצה חם (ראה טבלה 1) זה טוב. לקבלת PDL מצופה מנות תרבית תאים 60 מ"מ לוח 1 – 1.5 מיליון OPCs ב 3 מ"ל של מדיום הפצת נשק גרעיני. בזהירות להחליף המכיל FBS בינוני התפשטות עם hr בינוני 3 התפשטות טריה לאחר ציפוי OPCs (להפוך OPCs בטוח המחובר כהלכה ואינו לסלק במהלך שינוי בינוני). המרת בינוני כל שני וחמישי. הערה: תרבויות החולדה OPC מוכנות באמצעות פרוטוקול זה הם בדרך כלל 90% טהורים עם microglia כסוג תא מזהם המרכזי, ואחריו האסטרוציטים. 5. Immunocytochemistry שימוש HIgM12 בתאים ראשוניים גלייה Immunofluorescence Triple-תווית באמצעות HIgM12, מב אנטי PSA, וסוג תא סמנים ספציפיים בתאי גלייה ראשיים מ WT ו NCAM KO עכברים בתנאי תא חיים, עכבר ומחוברות תווית 60% מעורבבים תרבויות גליה מעכברי WT ו NCAM KO גדלו על PDL מצופה25 coverslips מ"מ זכוכית עם HIgM12 (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו מב אנטי PSA (שיבוט 2-2B) (10 מיקרוגרם / מ"ל) ב- PBS השלימו עם FBS 10% ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפו תאים שלוש פעמים במשך 20 שניות כל אחד עם PBS קר כקרח השלימו עם FBS 10% ולתקן עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS, pH 7.4 במשך 15 דקות ב 25 ºC. שטפו תאים קבועים פעמים עבור 1 דקות כל אחד עם PBS בתוספת 10% FBS ו permeabilize תאים עם 0.1% Triton-X100 ב PBS, pH 7.4 ל -2 דקות ב 25 ºC. שטפו תאים פעמיים דקות 1 ותווית עם GFAP סמנים גליה (האסטרוציטים) או IBA-1 (מיקרוגליאה) (1 מיקרוגרם / מ"ל) ב- PBS בתוספת 10% FBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר. המשך עם תנאי immunofluorescence סטנדרטיים כולל DAPI המכיל הרכבה בינונית 31. הערה: שימוש שכותרתו fluorescently Fab 2 שברים כמו נוגדנים משני עבור אדם (HIgM12) ועכבר (אנטי-PSA מב, שיבוט 2 – 2B) IgMs מומלץ בחום. קח flתמונות uorescent ב 60X או הגדלה 100X. השתמש באותן גדרות מכשירות עבור כל תמונות ותמונות תהליך זהה. תיוג immunofluorescence של תאי גליה Endo-NF שטופל WT באמצעות HIgM12 כמו נוגדן ראשוני עכבר התרבות WT גליה מעורב גדל במשך 3 ימים Neurobasal השלימו עם 10% FBS ו תוסף B27 (1:50) על-מצופה PDL 25 coverslips מ"מ זכוכית. להוסיף Endo-NF (30 מיקרוגרם / מ"ל) עד בינוני תרבות 1 מ"ל ו דגירה לילה חממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). תאים תווית לחיות בקור עם HIgM12 ו GFAP סמן astrocytic פנימי לאחר קיבוע ו permeabilization כמתואר בשלבים 5.1.1 ל 5.1.5. קח תמונות ניאון ב 60X או הגדלה 100X. השתמש באותן הגדרות מכשירות עבור כל התמונות ולעבד זהה.

Representative Results

סעיף זה ממחיש דוגמאות של התוצאות ניתן להשיג על ידי לימוד האדם IgM ספציפיים PSA-אנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית. שימוש נוגדנים אנושיים IgM המכילים שרשרות אור ספציפיות Vκ במסגרות ביוכימיות ידי immunocytochemistry ניאון מוצג. HIgM12 immunoprecipitates אנטיגן שלה מ lysates מוח המוחין ופועל כסוכן גילוי (נוגדן ראשוני) ב כתמים מערביים. לא נוגדן אלוטיפ ולא חרוזים L agarose immunoprecipitate אנטיגן דומה, אשר מביא לידי ביטוי את הספציפיות של לנתץ (איור 1). כתמים מערביים באמצעות lysates CNS מעכברי WT ו NCAM KO להפגין את הספציפיות של HIgM12-קשירת PSA המכיל NCAM (איור 2 א). עיכול אנזימתי של רקמת מערכת עצבים מרכזית מעכברי WT באמצעות Endo-NF מזהה PSA מצורפת NCAM כמו epitope מחייב הספציפי HIgM12 (תרשים 2B). בשיטה שהותוותה לעיל, תרבויות microglial עכברוש IBA-1-החיובי של טוהר גבוה מתקבלות (איור 3). זמין מסחרי נוגדן אנטי PSA (שיבוט 2-2B) לא לתייג פני תא או ברכות PSA פנימיות קבוע permeabilized תאי microglial IBA-1-חיוביים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקנה אחד עם מחקרים שפורסמו בעבר, שמדווח אין ביטוי על פני קרום התא של PSA-NCAM ב microglia 16,41 HIgM12 לא לתייג אנטיגנים פני התא ב microglia עכברוש מטוהרים. מעניין, תיוג HIgM12 של תוצאות microglia קבועים permeabilized בתוך תאיים, דפוס perinuclear כי אינו מוגבל אברונים ספציפי (איור 3). תוצאות הן בניגוד לאלה שהושגו באמצעות נוגדן אנטי PSA IgG (שיבוט 735) 26, אשר מטרות PSA-SynCAM ב microglia ברמה של Golgi 41. בניגוד microglia, HIgM12ותא A2B5 יעד אנטיגנים משטח בתרבויות OPC העכברוש מועשרות בתנאי תא חיים (איור 4). תרבויות OPC מכילים ~ 5% מזהם תאים microglial. איור 5 מדגים דפוס מכתים פני קרום התא כמעט זהה בין HIgM12 ואנטי-PSA מב (שיבוט 2-2B) האסטרוציטים GFAP חיובי (איור 5 א). תיוג Immunofluorescent של האסטרוציטים Endo-NF-מתעכל WT לעומת חיץ האסטרוציטים WT שטופלו שליטה באמצעות HIgM12 מדגים את הנוכחות של PSA astrocytic (איור 5). הנוכחות של האסטרוציטים PSA חיובי in vivo עדיין יש לקבל אישור. איור 1: HIgM12 מעשים כמו "נפתח" סוכן ב Immunoprecipitations Immunoprecipitations מ lysate המוח הכולל של עכברים שלושה חודשים ישנים באמצעות HIgM12, בקרת isotype אדם HIgM.חרוזים L 126 או agarose רק בתור "לנתץ" סוכנים. חלבוני eluted נוהלו כתמים מערביים עם ממברנות נחקרו נגד HIgM12. משקולות מולקולרית של חלבונים eluted מן חרוזים מצופים HIgM12 היו בטווח של 160 – 200 kDa בנוסף שרשרת כבדה IgMs (~ 65 – 73 KDA). נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: HIgM12 מטרות חומצת Polysialic (PSA) מחצית על NCAM. Homogenates מוח א 'מבית P7, P13, P16 ו P27 NCAM להסתכם עכברי KO ובקרות להמלטת הטרוזיגוטיים נוהלו כתמים מערביים עם ממברנות נחקרו נגד HIgM12, PSA ו- β-יקטין כמו טעינה מלאה. <strong> B. 10 מיקרוגרם של lysate המוח עכבר בוגר WT ב NP40 1% ב- PBS, pH 6.5 טופלה endoneuraminidase N (Endo-N) (exo) נורמינידאז עם ייחוד פולימר חומצה polysialic α2-3 (Sialidase) או PBS לילה בשעה 37 ºC, לרוץ כמו כפילויות ב כתמים מערביים ומשש נגד HIgM12, PSA ו- β-יקטין כמו טעינה מלאה. נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: בהעדר PSA על עכברוש Microglia משתקף בחוסר HIgM12 תיוג microglia עכברוש היו בתרבית למשך 48 שעות על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין ואו שכותרתו חי על קרח עם HIgM12 או לאחר קיבוע עם HIgM12 או אנטי. -PSA מב (שיבוט 2-2B). התאים היו triple שכותרתו עם microglia סמן IBA-1 (ירוק), HIgM12 / PSA (אדום) ו DAPI (כחול). תמונות להראות חוסר פני התא microglial מחייב שימוש HIgM12 (בשורה העליונה) וחוסר אנטי PSA מחייב (שיבוט 2-2B) אל פני התא וחנויות הפנימית microglia עכברוש הראשי (בשורה התחתונה). בהתבסס על מורפולוגיה בהעדר דו קוטביות של מכתים IBA-1, תא PSA החיובי הקטן (בשורה תחתונה) הוצע להיות OPC. בתאים קבוע, מכתים HIgM12 הביא לדפוס punctated, perinuclear כי לא הוגבל אברונים ספציפיים ונחשב הלא ספציפית מחייב (בשורה האמצעית). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4: HIgM12 מטרות Cell Surface PSA-NCAM על עכברוש OPCs עכברוש OPCs ו microglia היו cultu.אדום עבור 4 ימים במדיום התפשטות על coverslips זכוכית מצופה poly-D- ליזין ומשולשים שכותרתו חי על קרח עם HIgM12 או A2B5 (ירוק), CD68 סמן מקרופאג / מונוציטים פנימי (שיבוט ED-1) (אדום) ו DAPI (כחול) . תמונות להראות אוכלוסיות תאים חיובית majorly עבור OPC סמן A2B5 (בשורה העליונה) ו HIgM12 (בשורה התחתונה) עם כמה microglia CD68 חיובי (~ 5%). בניגוד שלב ותמונות DAPI נוספו לחשוף שלמות התא מספרים סלולריים עבור כל האוכלוסייה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: HIgM12 ו מב אנטי PSA שיתוף לסימון subpopulation astrocytic עכבר מעורבת גליה. א מאוס מעורבים ותאי גלייה מ WT ו NCAM להסתכם חיות KO המכילות האסטרוציטים, תאי שושלת oligodendrocyte ו מיקרוגרםליה היו בתרבית במשך 3 ימים ומסומן חי על קרח עם HIgM12 (ירוק), אנטי-PSA מב (שיבוט 2-2B) (אדום), ובהמשך עבור סמן astrocytic GFAP (סגול) ו DAPI (כחול). HIgM12 ו-PSA אנטי לחשוף דפוס מכתים זהה ווירטואלי על האסטרוציטים WT GFAP חיוביים, אך עדיין חסרי מחייב האסטרוציטים תרבותיים מעכברי KO NCAM. נתון זה יש הבדל בין J. Neurochem. 15. ב מעורבת גליה היו בתרבית זהה כמתואר תחת א והתייחסו לילה עם endoneuraminidase-NF (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר מרטינה Muehlenhoff) או שליטה PBS. תאים תויגו חי על קרח עם HIgM12 (ירוק) ובהמשך מוכתם עבור GFAP סמנים פנימי (אדום) ו DAPI (כחול). HIgM12 מטרות אנטיגנים פני תא על שליטת PBS שטופל תרבויות גליה מעורבות אבל לא endoneuraminidase-NF מטופלי גליה מעורבת. נתון זה יש הבדל בין 16 JNSCI. Plלהקל לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. כל התמונות צולמו בהגדלה 60X באמצעות אותן הגדרות מכשירות ומעובד באופן זהה. טבלה 1:. הצפת פתרון מתכונים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה. רקמת מערכת העצבים המרכזית Endo-NF / PBS חיץ תמוגה נפח כולל 1. עכבר WT 67 מיקרוגרם (0.45 μl) 2 μl (12 מיקרוגרם) Endo-NF 7.55 μl 10 μl 2. עכבר WT 67 מיקרוגרם (0.45 μl) 2 μl PBS 7.55 μl 10 μl 3. עכבר WT 67 מיקרוגרם (0.45 μl) לא PBS או Endo-NF 9.55 μl 10 μl 4. NCAM KO העכבר 67 מיקרוגרם (0.45 μl) 2 μl (12 מיקרוגרם) Endo-NF 7.55 μl 10 μl 5. NCAM KO העכבר 67 מיקרוגרם (0.45 μl) 2 μl PBS 7.55 μl 10 μl 6. NCAM KO העכבר 67 מיקרוגרם (0.45 μl) לא PBS או Endo-NF 9.55 μl 10 μl טבלה 2: Endo-NF העיכול של רקמת מערכת העצבים המרכזית מ P7 WT ו NCAM KO עכברים.

Discussion

נוגדנים עצמיים IgM טבעיים אדם פונים מועמדי immunotherapies ו הוכיחו פוטנציאל טיפולי לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן והפרעות במערכת עצבים מרכזיים 1-7. לתועלתו, נוגדנים אלה לא לעורר תגובה חיסונית אשר הדור של נוגדנים מנטרלים מפחית את המינון טיפולי האפקטיבי משמעותי ויעילות. חשוב לציין, כל הנוגדנים עם פוטנציאל טיפולי היו של אלוטיפ IgM ושייכים הרפרטואר NAB 3-5,8,9,37,40,42-45. משוכה גדולה עבור היישום הקליני הפוטנציאל של נוגדני IgM היא זיהוי של אנטיגנים שלהם, אשר לא ידועים במקרים רבים. טכניקות סטנדרטיות מועסקות נוגדני IgG הן בדרך כלל לא ישים לזהות אנטיגן של IgM.

פרוטוקול זה מתאר את זיהוי של PSA-NCAM כמו אנטיגן עבור HIgM12 נוגדני IgM אדם רגנרטיבית, יעיל במודלים של בעלי חייםשל MS ו- ALS 15-18. המתודולוגיה בשימוש ישימה בעיקר לכל נוגדנים אנושיים עם שרשראות אור Vκ ספציפיים VκI, VκIII ו VκIV ונוגדנים העכבר עם שרשראות אור VκI, ללא קשר אלוטיפ של נוגדן.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא השימוש נוגדני IgM ביישומי כרומטוגרפיה זיקה. באופן ספציפי יותר, נוגדנים מוצלחים נדרשים לפעול כסוכנים הנפתח ב immunoprecipitations לבודד או להעשיר אנטיגן מתוך lysates רקמות או תרבית תאים המורכב. שברי אנטיגן מועשרים ניתן להשוות immunoprecipitations מ נוגדנים לשלוט אלוטיפ ובהמשך נתחו להבדלים ידי ספקטרומטריית מסה. אחת דרישה הכרחית או הגבלה של שלב זה היא הנוכחות של שרשרת אור מארח הנכון נוגדן Vκ (אדם, העכבר) כדי לאפשר נוגדן מחייב agarose חלבון L. שימוש חלבון mannan מחייב בהכרח agarose (גם Calleד מנוז מחייב לקטינים) במקום agarose חלבון L היא אלטרנטיבה פוטנציאל immunoprecipitate IgMs ללא שרשראות אור ספציפי Vκ. עם זאת, כאמור על ידי ארנולד et al. 35, נוגדנים IgM הנכנס אנטיגן לא להיקשר לחלבון mannan מחייב, כמו glycan היעד נראה הופכים נגישים פעם IgM הכפיף אותו אנטיגן שלה. בהתבסס על ממצאים אלו mannan מחייב חלבון לא ניתן להשתמש כמטריצה ​​מחייב immunoprecipitate טעון אנטיגן IgM מולקולות 35. חלופות אפשריות אחרות עשויות להיות שימוש נוגדנים אנטי-IgM agarose הנכנס משני IgG 46,47 או שימוש חרוזים מגנטיים המופעל משטח 48. נוגדני IgG מכוונים נגד IgMs יכולים להיות crosslinked כימי agarose A או agarose G על מנת לצמצם את היקף נוגדן eluted יחד עם האנטיגן של עניין. השוואה נכונה בין גרסאות שונות של immunoprecipitation IgM ביחס אנטיגנים זיהו בהצלחה iזה קשה כי רוב immunoprecipitations בוצע כדי לבודד או לרוקן IgMs ללא ריבית נוספת אנטיגנים שלהם. בנוסף, immunoprecipitations באמצעות IgMs שמש בעיקר כדי לאשר אנטיגן כבר ידוע או צפוי יחיד עם חשיפת נוגדנים לאנטיגנים מטוהרים 49. חסרון של IgGs מצמיד agarose מכוון נגד אדם IgMs הוא תשואה נמוכה מאוד (10 – 15%) של מולקולות immunoprecipitated בסרום IgM כשמשווה את החומר המוצא 50. לעומת זאת, חרוזים מגנטיים המופעל משטח יושמו בהצלחה לנוגדנים של isotypes השונה כולל IgM כדי immunoprecipitate סיבים הקשורים scrapie 48. שיטה זו אינה מצטמצמת אך קאפה ספציפי (Vκ) או למבדה (λ) שרשרות או שורה מסוימת ועשויה להרחיב בצורה ניכרת את הספקטרום של נוגדני IgM המשמשים immunoprecipitations.

צעד חשוב נוסף בפרוטוקול הוא היכולת של הנוגדן לתפקד בתור detecting נוגדן (נוגדן ראשוני) ב כתמים מערביים או פלטפורמות סריקה אחרות. נוגדנים מוצלחים חייבים למקד אנטיגן שלהם עם זיקה גבוהה מספיק כדי לאפשר אנטיגן מחייב בנוכחות דטרגנטים שאינם יונים או אולי יוניים. נוגדני זיקה גבוהים נפוצים בקרב נוגדני IgG-maturated זיקה, אבל פחות נפוצים בקרב נוגדנים של אלוטיפ IgM, שהיא אחת הסיבות מדוע יש יחסית מעט נוגדני IgM זמינים מסחרי כמו גילוי סוכנים במסגרות ביוכימיים. זיקה גבוהה המחייבת של נוגדנים מהווה דרישה immunoprecipitations של אנטיגנים מולקולרי עבור מערבי סופג. הפחתת ריכוזי חומר ניקוי או ההעדר המוחלט של דטרגנטים מאגרי IP או מאגר תמוגה מאפשרת אנטיגן מיקוד ידי נוגדנים נמוך זיקה באמצעות תחום Fab שלה. לעומת זאת, היכולת של הנוגדן למקד agarose חלבון L באמצעות חלק Fc שלו אינה מושפעת באופן משמעותי בקרב שולטת אלוטיפ על פני טווח של concen חומר ניקוי השונהtrations. עם זאת, ריכוז חומר ניקוי נמוך במאגר תמוגה חיץ IP מונע הפרעת קרום תא ובידוד של מולקולות ספציפיות. באופן דומה, ריכוז חומר ניקוי נמוך מאגרי כביסת כתם מערביים (למשל, PBS-T) מאפשר אנטיגן מחייב של נוגדנים בעלת זיקה נמוכה אך בעת ובעונה האחת מגדיל את הלא ספציפי מחייב ולכן הוא לא אופציה.

הנוכחות של ליבת חלבון אנטיגן היא דרישה נוספת עבור שיטה זו. חלבונים עם שינויי posttranslational (למשל, גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים) וחלבונים ללא שינוי, אך לא שומנים בלעדיים או פחמימות, ניתנים לזיהוי ב כתמים מערביים. זה לא ניתן immunoprecipitate שומנים (למשל, ספינגוליפיד) מ lysates רקמות או תאים בנוכחות או בהיעדר דטרגנטים. מאפייני physicochemical של דטרגנטים ושומנים דומים מכדי לאפשר אינטראקציות שומנים-נוגדן סלקטיבי, בעוד באותו הזמן דטרגנטים חיוניים לשבשממברנות כדי לאפשר בידוד סלקטיבי של מולקולות ספציפיות. למיטב ידיעתנו, immunoprecipitations המורכב אך ורק של פחמימות, בהעדר גרעין חלבון, לא דווח בעבר. זה הופך רלוונטי במיוחד בגלל נוגדנים IgM לעתים קרובות למקד פחמימות glycolipids, אשר אינן צמודות בהכרח ליחידת חלבון. טכניקות chromatographic אחרות נדרשות לזיהוי ההפרדה אימונולוגית של שומנים ופחמימות בהיעדר גרעין חלבון. לדוגמא, כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) של שומנים הסלולר עם זיהוי נוגדן עוקב על צלחת TLC (החיסונית TLC) ניתן ליישם 51,52.

נוגדנים נגד ה- PSA אחרים תוארו במחקרים קודמים ותוצאות לעומת HIgM12 וכן IgM אנטי PSA הזמין המסחרי (שיבוט 2-2B). הנוגדן הנפוץ ביותר בתחום ה- PSA הוא נוגדן IgG (שיבוט 735) זמין עכבר monoclonal או ארנב polyclonal נוגדן 53. נוגדן אנטי PSA IgG זה מזהה PSA על SynCAM ו NCAM על תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית כולל תאים microglial 41. בניגוד הנוגדן IgG אנטי PSA, נוגדנים IgM האדם HIgM12, HIgM42 ואת IgM העכבר אנטי PSA (שיבוט 2-2B) אינם מסוגלים למקד PSA על SynCAM (אבל על NCAM) בשעה שלבי הלידה העוברית המוקדמת שונים בעכברים ואילו SynCAM הלא polysialylated ניתן לזהות בקלות 15. הנוגדנים IgM בהם נעשה שימוש הם גם לא מסוגל לזהות PSA על תאים microglial (איורים 3 + 4). הסבר אפשרי ההבדלים שנצפו בין isotypes נוגדנים עשוי להיות רמות נמוכות PSA-SynCAM לעומת רמות של PSA-NCAM בשילוב עם זיקה פוטנציאלית נמוכה יותר מחייב של נוגדנים IgM לעומת IgG אנטי-PSA. כדי לבחון השערה זו, ביצענו immunoprecipitations בחיות NCAM KO בשלב העוברי E17 עם כמויות עצומות של ההווה SynCAM והשתמשו HIgM12 בתור "סוכן הנפתח" <sup> 15. בשנת להמלטה WT E17 שולטת HIgM12 immunoprecipitated PSA-NCAM במידה שהראו בעוצמות דומות של "הוריד" PSA-NCAM לעומת שרשרת IgMs כבד כפי שזוהו על ידי צפיפות ב כתם המערבי לאחר מכן באמצעות אנטיגנים eluted. תוצאה זו הציעה לפחות זיקה מספקת של HIgM12 כדי PSA היעד שלה. בניגוד להמלטה WT שולט HIgM12 לא לזהות PSA המצורפת SynCAM בחיות KO NCAM. תוצאות זהות התקבלו immunoprecipitations באמצעות IgM HIgM42 אנטי PSA האדם. HIgM12 ו HIgM42, כמו גם את העכבר אנטי PSA IgM (שיבוט 2-2B) לא הצליחו למקד PSA על SynCAM ב כתמים המערבי מחיות WT ו NCAM KO בשלבים התפתחותיים עובריים לאחר הלידה. בהתחשב בכמות הנמוכה של HIgM12 נדרשה (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לזהות PSA מצורפת NCAM דווקא כתמים מערביים באמצעות כמויות קטנות של רקמת מערכת עצבים המרכזית (CNS 0.1 מיקרוגרם רקמה לכל טוב) 15 זה נראה סביר כי זיקות נמוכות לבד הםאחראי חוסר מוחלט של זיהוי PSA-SynCAM ידי HIgM12 בשלוש שיטות שונות.

אנו מסיקים כי ישנם הבדלים משמעותיים בין נוגדנים נגד ה- PSA IgM ואת נוגדן IgG אנטי PSA המפורסם התדיר (שיבוט 735). לא ברור מדוע זמינים מסחרי נוגדנים נגד ה- PSA IgM לא היו רגילים בתדירות גבוהה יותר בעבר לאשר את תוצאות שהושגו עם antiPSA IgG נוגדנים 735. זה מעניין במיוחד משום HIgM12 כבר הוכיח יעיל במודלי מחלה שונים. בעוד נוגדנים נגד ה- PSA IgM אחרים עשויים להיות השפעות טיפוליות דומות עדיין לא ברור האם נוגדן IgG אנטי PSA (שיבוט 735) יש תוצאה טיפולית דומה במודלים של טרשת הנפוצה ALS.

בקיצור, השיטות שתוארו כאן שימשו בעיקר כדי לזהות את האנטיגן של HIgM12 נוגדן אנושי משובי לתמוך בניסויים קליניים פוטנציאל MS ואולי מחלות ניווניות אחרות. זיהוי של נמלהigens נוגדנים בעלי פעילות ביולוגית הוא צעד חיוני כדי להבין את מנגנון הפעולה שלהם. זה הופך רלוונטי במיוחד בהקשר של נוגדנים חד שבטיים רבים בימים אלה נבדקים על בטיחות ויעילות בניסויים בבני אדם. בעוד מספר נוגדנים IgM נבדק קלינית עד כה הוא קטן, השיפורים האחרונים בטכנולוגיה hybridoma יחד עם מספר גדל והולך של מחקרים המדגיש את הפוטנציאל הטיפולי של הכיתה נוגדן זה 1-10,37,40,42-45 קורא מפיתוח מוצרים חדשים וחדשניים או שיטות שונות ישים לזהות אנטיגנים IgM הלא חלבון.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 GM092993, R01 NS048357 ו R21 NS073684), הקרן הלאומית למדע (פרס קריירה), פרס שותפות מינסוטה לביוטכנולוגיה והרפואי Genomics, האגודה לטרשת הלאומית המרובה (CA1060A) , ואת המרכז המרפא מאיו למדע קליני Translational (CCaTS). המחברים מודים תמיכה מן אפלבאום, הילטון, פיטרסון ומקרנות סנפורד, הירח ומרילין פארק קרן מנהלות ומשפחת McNeilus.

Materials

DMEM Fisher Scientific MT-10-013-CVRF HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 10,000 U/mL, 100 ml
N-2 Supplement (100X) Life Technologies 17502-048 5 ml
B-27 Supplement (50X) Life Technologies 17504-044 serum free, 10 ml
Fetal Bovine Serum – Optima Atlanta Biologicals S12450 500 ml
STERILE WATER FOR IRRIGATION Baxter Healthcare #2F7114 USP-1000 ml, 12/CA
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7886-50MG D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg
bovine serum albumin fraction V Sigma A-3294-100G heat shock fraction, protease free, pH 7,  purity 98%, 100 g
D-(+)-Glucose Sigma G5767-500G C6H12O6,

Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g
Trypsin from bovine pancreas Sigma T9935-100mg essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein,
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025-150KU Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein
Recombinant Rat FGF basic Protein R&D systems 3339-FB-025 BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa
Recombinant Rat PDGF-AA Protein R&D systems 1055-AA-50 carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid
Paraformaldehyde Sigma P6148-1KG crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer)
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas Biorad #1610719 1 kg, 99.8% pure, powder
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Biorad #1610302 1 kg, powder
Glycine Fisher Scientific BP-381-5 C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg
Sodium chloride Sigma S7653-5KG NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg
Sodium phosphate monobasic Sigma S0751-500G NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) Cellgro MT-21-040-CV Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning Life Sciences #353002 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish Corning Life Sciences #351007 Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack
6 well cell culture plates Corning Costar CLS3516 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c
75cm² tissue culture flask Corning Life Sciences 430720U 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap
Pierce™ Protein L Plus Agarose ThermoFisher Scientific #20520 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Biorad 456-1094 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells
Immobilon-P Membrane Millipore IPVH00010 PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone Millipore MAB5324 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM
XT sample buffer (Western blot) Biorad #1610791 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer
2-mercaptoethanol Biorad #1610710 25 ml, 98 % pure, 14.2 M
Endoneuraminidase-N (Endo-N) ABC Scientific ABC0020 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg
25 mm glass coverslips Fisher Scientific 12-545-102 Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm
HEPES buffer solution ThermoFisher Scientific 15630-080 100 ml, 1M
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) Cellgro MT-21-022-CV 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Papain Worthington Biochemical Cooperation LS003119 lyophilized powder, 100 mg
Magnesiumsulfate Sigma M-2643-500G powder, 500 g
L-Glutamine Gibco #25030-081 100 ml, 200 mM 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
  2. Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
  3. Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. J Autoimmun. 29 (4), 295-302 (2007).
  4. Vollmers, H. P., Brandlein, S. Natural antibodies and cancer. N Biotechnol. 25 (5), 294-298 (2009).
  5. Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
  6. Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
  7. Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
  8. Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
  9. Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
  10. Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
  11. Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
  12. Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
  13. Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
  14. Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
  15. Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
  16. Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
  17. Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
  18. Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
  19. Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
  20. Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
  21. Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
  22. Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
  23. Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
  24. Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
  25. Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
  26. Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
  27. Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
  28. Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
  29. Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
  30. Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
  31. Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
  32. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
  33. Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
  34. Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
  35. Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
  36. Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
  39. Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
  40. Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
  41. Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
  42. Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
  43. Vollmers, H. P., O’Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
  44. Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
  45. Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
  46. Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
  47. Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
  48. Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, S31-S36 (2010).
  49. Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
  50. Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3′-isoLM1 3′,6′-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
  51. Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
  52. Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).

Tags

Antibody BindingKappa Light ChainIgM AntibodiesPolysialic AcidNCAMAntigen IdentificationTherapeutic PotentialIgM IsotypeBiomarkersImmunotherapeutic Agents암 연구학Central Nervous SystemLysateImmunoprecipitation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Wootla, B., Painter, M. M., Warrington, A. E., Carey, W. A., Rodriguez, M. Antibody Binding Specificity for Kappa (Vκ) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study. J. Vis. Exp. (112), e54139, doi:10.3791/54139 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image