실시간 PCR에 의한 연안 퇴적물 및 정량 16S의 rRNA의 유전자 및 성적 증명서에서 동시 DNA-RNA 추출
Summary
A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Abstract
또한, 정량적 PCR (Q-PCR)으로 알려진 실시간 중합 효소 연쇄 반응은 환경 시료 분류학 및 관능기 유전자 존재비 정량화 미생물 생태에서 널리 사용되는 도구이다. 역전사 반응 (RT-Q-PCR)와 병용되는, 또한 유전자 전 사체를 정량화하는데 이용 될 수있다. Q-PCR 반응의 지수 적 단계의 PCR 증폭 산물의 정량을 허용 고감도 화학 형광 검출을 사용한다. 따라서, PCR 반응의 고원 위상 검출 '끝점'PCR과 관련된 편향 방지된다. 프로토콜은 PCR이 제공되는 실시간 통해 해안 퇴적물에서 세균의 16S rRNA의 유전자와 성적 증명서를 정량화한다. 첫째, DNA가없는 RNA의 제조를 위해 요구되는 추가 단계를 포함 해안 퇴적물에서 DNA와 RNA의 동시 추출을위한 방법은, 설명한다. 둘째, 16S rRNA의 유전자와 TR의 정량화를위한 단계별 가이드Q-PCR 및 RT-Q-PCR을 통해 추출 된 핵산에서 anscripts이 설명되어 있습니다. 이것은 DNA와 RNA 표준 곡선의 건설을위한 세부 사항을 포함한다. 미생물 생태학에서 RT-Q-PCR 분석의 사용에 대한 주요 고려 사항이 포함되어 있습니다.
Introduction
미생물 생물권 구동 생태계 기능의 모퉁이 돌입니다. 미생물의 대부분은 한 교양 남아있다. 따라서 분자 기반의 접근 방식은 환경에서 미생물의 다양성과 기능에 대한 우리의 이해를 발전의 기초입니다. 이러한 방법으로 중앙 환경 시료로부터 핵산을 추출하고 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 표적 유전자의 후속 증폭이다.
DNA / RNA 추출의 제 1 단계는 미생물 군집 존재하는 세포벽을 용균 원하지 않는 핵산 분자 (예를 들어, 유기 및 무기 물질)를 제거하고 상기 다운 스트림 분석 용 용액 DNA / RNA를 유지하는 것이다. 상용 추출 키트의 범위를 포함 문헌 2,3,4,5에서 사용할 수있는 몇 가지 옵션, 중, 그리피스 방법 6 널리 7,8,9를 사용한다. 이는 경제적 인 및 PA이 세포를 용균하는 비드 치는 공정을 사용하여 동시에 DNA 및 RNA를 회수하는 동안, 이러한 부식 산과 같은 PCR 억제제의 동시 추출을 최소화하는 단계를 포함로 rticularly 잘 퇴적물에 적합한.
두 번째 단계는 상기 추출 된 핵산에서, 예컨대 16S rRNA의 분류 학적 마커로서 표적 유전자를 증폭하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용한다. 이 방법은 보유하고지지 않은 미생물 블랙 박스 10, 11의 탐사를 촉진하고 있습니다. 그러나, 엔드 포인트 PCR 기반의 방법은 여러 가지 제한으로 고통 그 수는 바이어스 미생물 군집 (12)의 특성을. 정확하게 유전자 / 사체 존재비를 정량화하기 위해, 정량적 PCR (qPCR에)라고도 실시간 PCR이 사용되어야한다. qPCR에는 PCR의 매 사이클 후 앰플 리콘 축적을 추적 형광 리포터 염료 시스템을 이용한다. 이 정량화가 아니라, 초기 지수 단계에서 발생할 수 있다는 것을 의미한다 이것은 중요하다앰플 리콘 수율 여전히 표적 유전자의 최초 풍부 정비례 종점은 PCR 반응의 위상보다.
두 리포터 시스템은 일반적으로 사용된다 :는 인터 핵산 얼룩 (13) 및 DNA 폴리머 라 아제 (14)의 5 '3'엑소 뉴 클레아 제 활성. 전 리포터 시스템은 모든 이중 가닥 DNA에 결합하기 때문에 불필요한 indistinctively 비특이적 증폭 산물 또는 부산물 프라이머 다이머가 발생할 경우에는 표적 서열의 과대 추정을 초래할 수도있다. 이것을 회피하기 위해, 증폭 광범위한 최적화가 요구 될 수있다. 후자의 시스템에서, 템플릿 증폭은 절단 내부에서 형광 프로브를 Taq 중합 효소의 5 '뉴 클레아 제 활성의 조합을 사용하여 추적된다. 이 기능으로 인해 보완적인 목표 별 sequenc에만 결합하는 형광 프로브의 이용에 분석의 특이성을 증가프라이머 쌍의 전자. 화학 양으로 정량 형광의 증가에 의해 측정 된 PCR 증폭 산물의 축적이 현저히 배경 형광 위에 교차 포인트 (CP)를 결정함으로써 달성된다.
qPCR에 광범위하게 다른 환경 15 유전자 존재비를 결정하는 미생물 생태에 사용되어왔다. 또한, cDNA를 RNA로 역전사는 유전자 발현을 qPCR의 정량화 및 RT-qPCR에 결합된다. 따라서, qPCR에와 RT-qPCR에 환경 시료 내 유전자 및 / 또는 성적 증명서 수의 정량 빠르고 효과적인 방법을 나타냅니다.
해안 퇴적물의 미생물은 유기물의 광물, 오염 물질의 분해 및 질소 16,17,18 등의 다량 영양소의 생지 화학 순환 등 다양한 생태계 프로세스를 구동한다. 이러한 변환의 철저한 이해는 포괄적 인 accoun이 필요합니다유전자 및 성적 증명서 존재비에 대한 정량적 인 데이터를 포함 기여하는 미생물 집단의 t. 여기에서 우리는 해안 퇴적물의 세균의 16S rRNA 유전자 및 성적 증명서 존재비의 정량화를 위해 철저하게 테스트, 간소화 및 표준화 된 프로토콜의 시리즈를 소개합니다. 프로토콜은 시료 채취 동시 DNA 및 RNA 추출, DNA-RNA 프리 전처리, 추출 된 핵산의 품질 검사, 16S rRNA의-DNA와 -RNA 표준 환경 시료의 정량의 생성을 설명합니다. 여기에 기술 된 방법에서 파생 된 정량적 데이터는 연안 생태계를 구동 미생물 지역 사회에 빛을 흘렸다 필요하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
qPCR을 가진 DNA / RNA 추출의 조합은 해안 퇴적물 등 환경 샘플의 범위에서 유전자 전 사체 존재비 민감한 정량 빠르고, 정확하고, 비교적 비용 효율적인 방법을 제공한다.
초기 핵산 추출은 22 달성 미생물 커뮤니티 본 대표 시야를 확보하기위한 중요한 공정이다. 억제 성 화합물 (예를 들면, 휴믹산이나 폴리 페놀의) 총 세포 용해의 달성, b) 공 추출)를 RNA 분획에있어서, c) 오염 DNA, d) : 많은 제한이 추출 프로토콜을 고려할 필요 저장 추출한 핵산 분해성. 주의 사항은 이러한 제한을 우회하기 위해주의해야한다. 예를 들어, 특별한주의 핵산 추출 시료 유형 (예를 들어, 퇴적물, 토양, 하수 등을 위해 최적화 될 수 있도록 수행되어야). DNA 및 RNA 모두 핵산의 수율 및 품질을 크게 향상 예비 실험 23을 실시함으로써 달성 될 수있다. PCR 기반 애플리케이션 (24)에서 억제 성 화합물의 효과를 최소화하기 위해, 추출 된 DNA와 RNA의 희석액 범위를 테스트한다. 여러 동결 해동 사이클에서 추출 된 DNA / RNA의 급속한 저하를 회피하고 -80 ° C에서 유전 정보의 손실 가능성, 저장 다수의 소량 씩을 방지 할 수 있습니다.
신중하게, qPCR에 설계 할 때 A, 강력한 높은 재현성 및 민감한 방법이다. 특히,이 프로토콜에 명시된 증폭 및 표준 곡선의 건설을위한 방법은 다른 계통 마커 (즉, 고세균 16S의 rRNA의, 곰팡이 18S의 rRNA의) 또는 환경에서 중요한 기능에 관여하는 유전자를 포함하는 관심의 유전자 대상에 대해 적용 할 수 있습니다. qPCR에 사용 알려진 한계가있다 : 재현성이 고품질 s의) 생성절대 정량 tandard 곡선, b) 프라이머 / 프로브의 선택 및 Q-PCR 분석 조건의 최적화, c) 저품질 / 전단 핵산, d) DNA / RNA의 작용 희석액의 선택의 사용 금지를 피하기 . 또한,이 qPCR의 기술은 수를 셀에 동등하지 않을 수도 유전자 / 사체 존재비를 제공하는 것이 고려되어야한다 : 미생물들이 게놈 리보솜 유전자의 다른 사본 번호가 이것은 16S 및 18S rRNA의 유전자를 표적으로하는 경우는, 특히 인 25.
품질이 낮은 표준 곡선은 관심있는 유전자의 부정확 한 정량화가 발생합니다. 신선한 표준 곡선이 만들어 질 수있는 작은 분량 씩 높은 농도 수준의 재고를 저장하는 것이 좋습니다. 표준 곡선을 보관하지 마십시오, 항상 가장 높은 농도마다의 재고에서 신선한 희석합니다. 환경 시료의 정확한 정량을 위해 스탠의 농도의 범위를 확인바 닥 곡선은 미지 시료의 예상 CP 값에 걸쳐있다. 성적 증명서를 정량화 할 때, 가닥 DNA를 두 번하지 RNA의 표준 곡선을 구성. 가능한 경우 직접 비교 될 샘플의 정량 분석 간 편차 20을 피하기 위해 하나의 분석 내에 완료되어야한다. 이것은 항상 가능하지 않을 수 있습니다. 따라서, 분석 사이에 발생 유전자 존재비를 비교하기는 분석간에 복제 샘플의 임의의 서브 세트를 가지고하는 것이 좋습니다. 프라이머 및 프로브 세트의 다양한 현재 qPCR에 미생물 분류군과 대상 그룹의 최대 범위와 특이도 모두를 위해 다음을 선택할 때 15주의 깊은 고려가 필요한 기능 그룹을 대상으로 사용할 수 있습니다. 의 qPCR 분석의 반응 효율이 만족스럽지 않은 경우, 문제는, 예를 들어, 및 / 또는 반응 조건 (열처리 시간 및 / 또는 온도가 같은) 다른 열 사이클링 조건 테스트 프라이머 프로브 농도를 변화 시작한다. 영형질문-PCR 분석 및 반응 조건을 최적화 NCE 항상 적절한 템플릿 농도를 결정하는 DNA / cDNA의 희석액 범위의 초기 테스트를 수행. 추가 분석을위한 최적의 템플릿 희석으로 가장 높은 카피 수의 결과로 희석 범위를 선택합니다.
현재 차세대 시퀀싱 기술을 효율적으로 환경 26,27,28의 과다에 미생물 군집 구조와 기능에 빛을 흘렸다. 그러나 이러한 데이터 세트는 종종 엔드 포인트 PCR 증폭 물 라이브러리를 기반으로하기 때문에 특정 분류군의 풍요의 반 정량적 평가를 제공합니다. 따라서, 리얼 타임 PCR 계 기술의 능력이 특정 분류 학적 마커를 타겟팅 (다운 균주 수준 높은 도메인부터) 차세대 시퀀싱 한 결과를 효율적으로 검증 할 수있다. 또한 qPCR에 성공적으로 안정한 ISO 다른 미생물 생태 분자 방법과 조합하여 사용 된술을 많이 마시다 프로빙 (SIP) 또는 계통 / 기능 마이크로 어레이. 전 공구와 결합 qPCR에의 대사 활성 지역 (29, 30)을 계량 할 수있다. 마이크로 어레이 분석과 함께 사용하면 qPCR에는 환경 (31, 32)의 계통 발생 학적 마커 기반 및 기능성 유전자 설문 조사의 주요 정량적 인 해석을 제공합니다.
따라서 여부를 단독으로 또는 생태계 기능의 다른 (종종 프로세스 기반) 평가와 함께 사용, 정량적 PCR은 미생물 군집 및 생태계 기능 사이의 애매 링크의 탐사 미생물 생태에 필수적인 도구입니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 책은 허가 번호 NERC NE / JO11959 / 1 과학 재단 아일랜드 및 CJS에 허가 번호 11 / SIRG / B2159awarded에서 마리 퀴리 액션 COFUND 아래에있는 자연 환경 연구위원회 (NERC)의 재정 지원으로 수행 연구에서 발산했다 및 동부 학술 연구 컨소시엄 (동부 ARC).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
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