Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

生物多様性が生じたどのように理解する1つの基本的な構成要素は、自然の中で進化した表現型変化の遺伝と発達拠点を決定することです。イトヨの魚、Gasterosteusアクレータスは 、進化の遺伝的基礎を研究するための優れたモデルとして登場しました。トゲウオは、海水魚は北半球の周りに無数の淡水環境を植民地化してきたように劇的な形態的、生理的で、その結果、多くの適応進化的変化を遂げ、としている行動の変化^1。 20個の-1つのトゲウオ集団からの個人のゲノムを配列決定し、組み立て、及び高密度連鎖地図は、さらに、アセンブリ^2,3を改善するために生成されているされています。遺伝的マッピング実験は、進化した表現型を⁴基礎となるゲノム領域を同定した^{– 6を} 、そしていくつかのケースでは、特定の候補遺伝子の機能的役割は^、7,8をテストされています。形態学的変化の根底にあるゲノム領域の数は、有望な候補遺伝子と同定されているが、これらの候補者はまだ機能的に⁹試験されていない^{– 12。}また、トゲウオは集団遺伝学/ゲノミクス^13,14、分化^15、動作^1、内分泌学^16、生態毒性^17、免疫学¹⁸および寄生虫¹⁹の研究のための一般的なモデルです。これらの各フィールドにおける今後の研究では、トゲウオで機能的な遺伝子操作を実行する能力の恩恵を受ける。そのコード配列を操作することに加えて、候補遺伝子の役割は、それらのシス -regulatory配列を研究することによって、および機能的に、増加減少、または候補遺伝子の発現を排除することによって評価することができます。トゲウオにおけるマイクロインジェクションおよび遺伝子導入方法がよく^7,8,20を確立されており、最初に使用して開発されたメガヌクレアーゼ媒介方法^21は、第1メダカ²²に記載します。ここで紹介する修正されたマイクロインジェクション法はTol2の媒介遺伝子導入およびTALENsとCRISPRs含む最近開発されたゲノム編集試薬の両方に最適化されています。

シス -regulatory変化が変異^23を符号化の負の多面的な結果を回避することができるようにシス -regulatory要素への変更は、形態学的進化に重要であると考えられています。そのため、テストと推定されるシス -regulatory配列を比較することは、進化の研究の増加の中心的な目標となっています。加えて、ほとんどのヒト疾患のバリアントは、調節変異体^24,25であり、モデル脊椎動物系が痛ん-regulatory要素の機能及びロジックシス研究するために必要とされます。大量に外部に彼らの胚を受精魚はシス -regulationを研究するための強力な脊椎動物システムを提供しています。 Tol2のトランスポゾンシステム、内forei^{28 –}ゲノムに組み込まれるべきGN DNAはTol2のトランスポザーゼ結合部位とTol2のトランスポザーゼmRNAと同時注入により隣接され、成功した魚のゲノム²⁶にプラスミド構築物を統合するための高効率で動作します。典型的には、潜在的なエンハンサーはTol2の骨格中に（例えば^、29 hsp70lなど）基本プロモーターならびにEGFP（強化緑色蛍光タンパク質）またはmCherryを、蛍光レポーター遺伝子の上流にクローニングし、トランスポザーゼmRNAの²⁶に注入されます。蛍光レポーターの、いずれかの注入した胚または安定に組み込まれた導入遺伝子を持つ子孫における発現の観察は、推定されるエンハンサーにより駆動される遺伝子発現の時空間制御に関する情報を提供します。さらなる実験では、検証エンハンサーは、目的の遺伝子の組織特異的過剰発現を駆動するために使用することができます。

より大きなシス -regulatory地域、高品質の大インサートGENOMの分析のために細菌人工染色体（BACの）を使用してICのライブラリは、両方の海洋および淡水トゲウオ³⁰のために構築されてきました。これらのBACは、大規模（150〜200キロバイト）のゲノム領域³¹の文脈における蛍光レポーター遺伝子と遺伝子を交換するrecombineeredすることができます。 BAC内の調節配列によって決定される蛍光レポーターは、次いで、時空間パターンで発現されます。魚類での研究のために、Tol2の部位は、ゲノム組込み^32,33を容易にするためにBACに添加することができます。 in situハイブリダイゼーション技術的に困難である場合トゲウオの骨形成タンパク質^{6（BMP6）20}のために示されているように、開発の後期段階では、BACの蛍光読み出しは、遺伝子発現のパターンを研究するために使用することができます。また、個々の蛍光の発現パターンは、in situハイブリダイゼーションを用いて達成することができない、時間をかけて追跡することができます。 BACがまたadditionaを追加するために使用することができますゲノム領域のL個のコピーは、目的の遺伝子の投与量を増加させます。

遺伝子機能の研究のために、ゲノム編集生物³⁴の多種多様なゲノム配列を標的とする変化を生成するために使用することができる爆発拡張フィールドです。転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）もともと正確な選択のゲノム配列に直接結合し、二本鎖切断^35,36を生成するように操作することができる植物病原体から単離されたモジュラー、配列特異的ヌクレアーゼです。クラスタ化された定期的interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CASシステムは、もともと細菌で発見され、ガイド³⁷と相補的な標的DNA配列の中断を生成するために、ガイドRNAとCas9タンパク質を使用しました。標的配列の機能を破壊することができ、多くの場合、小さな挿入または欠失を残すTALENsとCRISPRsの両方で作成された二本鎖切断のその後の修理、35-37。トゲウオにおいて、TALENsエンハンサー^20を標的とすることによって、遺伝子発現を破壊するために使用されており、TALENsとCRISPRs両方が正常配列（未発表データ）を符号化における変異を作製しています。ゼブラフィッシュにおける使用のためのCRISPRsの生成のための詳細なプロトコールは、トゲウオ³⁸ CRISPRsを開発するためのガイドラインとして使用することができます。

トランスジェニックゲノム編集の実験は、新たに受精した単細胞胚への核酸の導入を必要とします。開発の初期段階における導入遺伝子またはゲノム編集ツールを導入することにより、胚における遺伝子操作された娘細胞の数が最大化されます。注入した胚を視覚的蛍光についてスクリーニングまたは分子ゲノム修飾についてスクリーニングされます。生殖系列に寄与する細胞が正常に標的化される場合、導入遺伝子または変異は、ポスト噴射致死性が高い場合であっても、子孫のサブセットへ渡すことができます。モザイク魚は外部交配することができますかインタークロスとその子孫は、突然変異対立遺伝子または関心の安定に組み込まれた導入遺伝子を回復するためにスクリーニングしました。このプロトコルは、1セルトゲウオ胚に導入遺伝子およびゲノム編集の試薬を導入し、成功したゲノム修飾をモニタリングするための方法を説明します。