Administration intra-trachéale de<em> Haemophilus influenzae</em> Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour efficacement et livrons directement Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures des souris. Nous démontrons la procédure de préparation H. influenzae inoculum, instillation intra-trachéale de H. influenzae dans le poumon, la collecte du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), l' analyse des cellules immunitaires dans le BALF et l' isolement de l' ARN pour l' analyse différentielle de l' expression génique. Cette procédure peut être utilisée pour étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à une bactérie, un virus ou des champignons. endotrachéale directe instillation est le plus souvent préféré aux procédures d'inhalation par voie nasale ou d'un aérosol, car il fournit plus efficacement l'inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures avec moins d'ambiguïté.
Introduction
L'inflammation est un mécanisme immunitaire fondamental de la défense contre les agents infectieux. Il favorise l'élimination des agents pathogènes et la réparation des tissus endommagés. Il facilite également la récupération à un état de santé normal 1. Cependant, l' inflammation dérégulée conduit souvent à des maladies inflammatoires chroniques 2. Inflammation des voies respiratoires est un facteur déclenchant diverses maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), l' asthme et la fibrose pulmonaire 3.
La non typable (non encapsulé) , Haemophilus influenzae (NTHi) est associée à des maladies inflammatoires pulmonaires supérieures et inférieures à 4,5 chroniques. Ce sont les espèces dominantes isolées des voies respiratoires inférieures des enfants et des adultes avec 4,6,7 chronique de la maladie pulmonaire obstructive. La réponse inflammatoire après l'infection NTHi est caractérisée par la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF et l'IL-1β), et il est médié by mitogène protéine kinase activée (MAPK) et le facteur nucléaire-kB (NF-kB) grâce à des récepteurs Toll-like (TLR) 8.
Des modèles de souris sont des outils très utiles pour l'analyse de la pathologie sous-jacente de la maladie inflammatoire pulmonaire en raison de la disponibilité des différentes lignes de gènes déficients. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour inoculer des bactéries vivantes atténuées et / produits bactériens, y compris l' instillation intranasale et par inhalation sous forme d' aérosol 9,10. Ici, nous démontrons intra-trachéale instillation. Bien qu'ils soient utilisés moins fréquemment, cette approche est plus efficace et hautement reproductible en raison de la livraison directe de l'inoculum pour les voies respiratoires inférieures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un procédé unique et peu invasive pour inoculer les poumons de souris par un pathogène bactérien du poumon. Nous démontrons que cette procédure peut être utilisée pour étudier la fonction des différents gènes en utilisant des souris qui sont déficientes en gènes des voies de signalisation inflammatoires. Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les réponses inflammatoires à des infections virales et fongiques pulmonaires. Les avantages de cette procédure par rap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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