Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten
Summary
Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Abstract
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Introduction
Leukocyten zu den Kapillaren der Lunge anhaftenden (dh marginating-Lungen (MP) Leukozyten) 1 gezeigt wurden verschiedene Leukozyten – Zusammensetzung und einzigartige Aktivität aufweisen , verglichen mit Leukozyten von anderen Immun Kompartimente (zB Zirkulations, Milz, Knochenmark) 2- 4. Zum Beispiel, MP-Leukozyten zeigen eine höhere natürliche Killerzellen (NK) Zytotoxizität gegen verschiedene Tumorzellen, im Vergleich zu zirkulierenden und splenic NK-Zellen, sowie differenzierte Boten-RNA (mRNA) Ebenen und erhöhte Sekretion von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen. Die Zusammensetzung von Zellen ist auch aus der zirkulierenden Leukozyten unterschieden als MP-Leukozyten ein höheres Verhältnis von angeborenen / adaptive Immunität gegenüber zirkulierende Leukozyten (50% vs. 30%, jeweils). Das Ziel des hier vorgestellte Methode selektive Ernte von MP-Leukozyten zu ermöglichen, um diese wichtige und einzigartige Immunfach (Zellpopulation) zu untersuchen und zu eluciDate die Auswirkungen verschiedener Manipulationen (beispielsweise Immunaktivierung) auf diesen spezifischen Zellen.
Um die Bedeutung dieser einzigartigen Bevölkerung zu verstehen, ist es wichtig zu beachten , dass das Immunsystem steuern kann zirkulierenden Tumorzellen, Mikrometastasen und Resterkrankung durch in – vivo – Funktionen der zellvermittelten Immunität (CMI). Diese Fähigkeit ist offensichtlich trotz der Präzedenzfall Versagen des Immunsystems , den Primärtumor zu steuern und durch reichlich in vivo Nachweis von Krebspatienten und Tiermodellen 5 unterstützt. Wichtig ist , dass diese Ergebnisse oft nicht mit in vitro und ex vivo – Studien, die berichten , dass die meisten autologe Tumorzellen – Zytotoxizität durch zirkulierende Leukozyten in Blutproben von Menschen und Tieren (gemessen durch Zytotoxizitätsassays) resistent sind 6,7. Diese Diskrepanz kann auf die in vivo Existenz verschiedener Leukozyten – Populationen, wie der zuvor zurückzuführengenannten MP Leukozytenpopulation und seine Subpopulation von aktivierten NK – Zellen spezifisch 3. Tatsächlich syngene Tumorzellen (MADB106), das Zirkulieren und splenic Leukozyten resistent erwiesen worden waren, wurden durch MP-NK – Zellen werden lysiert 3,8 gezeigt. Somit werden die angeblich "NK-resistente 'MADB106 Zellen, die Lungen von fischer344 (F344) -Ratten metastasieren von MP-NK-Zellen kontrolliert, aber nicht durch zirkulierende oder splenic NK-Zellen, die gewöhnlich ihre leichte Zugänglichkeit gegeben sucht.
Gereinigte und aktive MP-Leukozyten sind nicht zugänglich über die Standard – Ernteverfahren von Leukozyten aus den Lungen, die auf das Lungengewebe Schleifen oder biologischen Abbau 9 basieren. Unser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile im Vergleich zu Gewebeverarbeitung Ansätze. Zunächst erntet die Perfusion Ansatz selektiv MP-Leukozyten, um sie von anderen Zellen zu trennen, die von der Lunge parenchymal, interstitielle stammen, und bronchoalveoläre compartments. Zweitens besser ist die Perfusion Technik bewahrt die Integrität und das physiologische Milieu von MP-Leukozyten, im Gegensatz zum Schleifen und biologische Verarbeitung Ansätze, die Zellen schädigen, ihre Morphologie zu verändern, und die Produktion und Freisetzung von verschiedenen Faktoren induzieren, die Immunaktivität modulieren und speziell NK unterdrücken Zytotoxizität 10.
Die Lungen sind eine wichtige Zielorgan für Krebsmetastasen und für verschiedene Infektionskrankheiten. Alle zirkulierenden malignen Zellen und infizierten Zellen gehen durch die Lungenkapillaren, wo sie benötigen, mit Endothelzellen und resident Leukozyten zu verformen und zu interagieren. Unter diesen Bedingungen können zirkulierenden Zellen leicht durch resident MP-Leukozyten ausgerichtet sein. Es scheint also von Vorteil, biologisch aktivierten Leukozyten in diesem Immunraum zu haben, und es ist wichtig, diese einzigartige MP-Population in verschiedenen biologischen, experimentellen und klinischen Einstellungen zu studieren. Es ist erwähnenswert, dass sy zu beachtenstemic Immunaktivierung durch verschiedene biologische-response-modifiers (zB Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly I: C) oder Typ-C CpG – Oligodesoxynukleotide (CpG-C – ODN)) wurden MP-Leukozyten mehr als zirkulierende Leukozyten 3 gezeigt , zu aktivieren , 8,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Verfahren ermöglicht hier die selektive Ernte und das Studium der einzigartigen Population von MP-Leukozyten. Im Vergleich zum Zirkulieren oder splenic Leukozyten wird die MP Population durch eine bestimmte Zusammensetzung der Leukozyten – Subpopulationen gekennzeichnet, höhere Aktivierungsstufen, höhere Freisetzung verschiedener Cytokine, und höhere mRNA – Spiegel von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen 2,3. Insbesondere haben wir gezeigt , dass die MP-NK – Zellen cytotoxischer als…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren und diese Arbeit wurden von NIH / NCI Zuschuss # R01CA172138 (auf SBE) unterstützt.
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O’Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
