encapsular citocromo<em> c</em> El aerogel de sílice en nanoarquitecturas sin metal nanopartículas Mientras Retienen bioactividad en fase gaseosa

gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de laboratorio deben ser usados ​​en todo momento durante el procedimiento. Nunca haga funcionar el aparato de secado de punto crítico sin necesidad de gafas o anteojos de seguridad. Todas las soluciones que contienen tetrametoxisilano, metanol, etanol, acetona, amoniaco y deben ser procesados ​​dentro de una campana de humos. 1. Asegúrese de búfer y Cit. C Soluciones Para hacer ~ 750 ml de pH 7, tampón de fosfato de potasio 40 mM, primero preparar 500 ml de fosfato monobásico de potasio 0,04 M pesando 2,72 g de fosfato de potasio monobásico y disolviendo en agua usando un matraz de 500 ml. Preparar 500 ml de fosfato dibásico de potasio 0,04 M pesando 3,48 g de fosfato dibásico de potasio y disolviendo en agua usando un matraz de 500 ml. Verter la solución de sal dibásico en un gran vaso de precipitados con una barra de agitación y comenzar la agitación de la solución en una placa de agitación. Poco a poco agregue partes de la sal monobásico sOlution a la solución de sal dibásico mientras se monitoriza el pH con un electrodo de pH y metro hasta que el pH es 7.00. Se utilizarán aproximadamente 250-300 ml de la solución de sal monobásico. Pesar aproximadamente 0,023 g de cyt. C y se pone en un vial de centelleo de vidrio. Añadir 2.000 l de tampón de fosfato de potasio preparado utilizando una micropipeta y luego agitar suavemente la solución a la mezcla hasta que todo el sólido cyt, rojo. C se ha disuelto en la solución y no la materia particulada que queda. Tomar 20 l de la solución preparada c cyt. Y añadir a un 1 cm de longitud del camino cubeta de plástico. Añadir 3 ml de tampón preparado. Tome espectro UV-vis 300-700 nm usando tampón en la celda de referencia. Utilice el cyt. C absorbancia (A) a 409 nm, el coeficiente de extinción 31 (ε) de 106.100 M -1 cm -1, la longitud del camino cubeta (l), y la ley de Beer-Lambert para determinar la concentración (c) de la solución (A = εlc). Volver calcular la concentración de la solución preparada originales. Los 2 ml prepararon cyt. Solución C está típicamente entre 0,7 a 0,9 mM en la concentración. Diluir la solución c preparado cyt. Original de 800 l de 0,105 mM pipeteando 117 l de 0,72 mM preparado cyt. Solución C en un vial de centelleo. A continuación, añadir el resto de los 800 l (683 l en este caso) de tampón preparado. Agitar para mezclar. Los volúmenes exactos variarán dependiendo de la concentración exacta de la cyt preparado originales. Solución C como el volumen de cyt. C de pipeta se calcula como (800 l * 0,105 mM) / (cyt originales. Concentración c en mM). Almacenar cyt preparado y diluido originales. C soluciones a 2-8 ° C en un refrigerador hasta que esté listo para su uso durante un máximo de dos semanas. 2. Sintetizar sílice (SiO2) Sol Etiquetar un desechable de 50 ml vaso de polipropileno 'SeaAker A '. Coloque un vaso sobre el plato de una balanza analítica y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para añadir 1,88 g tetrametoxisilano en el vaso. Cero la balanza y luego una pipeta 2,88 g de metanol en 'vaso Un'. Cubierta 'vaso Un' con Parafilm. Etiquetar un desechable de 50 ml vaso de polipropileno 'Vaso B'. Añadir una barra de agitación magnética y el lugar en el platillo de una balanza analítica. Utilice una pipeta de vidrio para añadir 0,75 g de agua y 3,00 g de metanol. Cubierta 'Vaso B' con Parafilm. Comience a agitar el contenido de 'Vaso B' en una placa de agitación dentro de una campana de humos, a continuación, utilizar una jeringa para insertar 5 l de solución de hidróxido de amonio 28,0 a 30,0% a través del Parafilm cubrir en la mezcla mientras se agita. Tan pronto como se haya completado el paso 2.5, añadir el contenido de 'Vaso A' a 'Vaso B'. Se agita la mezcla durante 20 min mientras está cubierto en Parafilm. 3. Preparar gel Moldes Nota: Noes tiempo para preparar los moldes de gel, mientras que la mezcla de sol de sílice se agita en el paso 2.6. Adquirir 8-9 viales de polipropileno de centelleo (16 mm x 57 mm, tamaño de volumen de 6,5 ml, con fondo en rodajas fuera) y las correspondientes tapas. Ponga una envoltura de plástico sobre el extremo de la tapa del frasco para crear una superficie plana para el gel para formar en la tapa y coloque sobre ella asegurándose de que la envoltura de plástico se mantiene intacta dentro de la tapa. Alinear los viales con tapón de extremo-abajo en la parte superior del banco y abrió fondos hacia arriba. 4. Preparar Cit. C -silica Sol-geles Tras la finalización de la mezcla sol (paso 2.6), añadir 3 ml de la mezcla de sol a un vaso de precipitados desechable de 50 ml de polipropileno limpio. Utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para soltar lentamente 500 l de los 0,105 mM diluido cyt. Solución C (realizada en el paso 1.9) a la mezcla de sol 3 ml en el transcurso de ~ 1 min. Asegúrese de agitar suavemente la mezcla durante la adición del cyt. C para evitar la formación de grandesgrupos rojas. Suponiendo que los volúmenes son aditivos, mediante la dilución de 500 l de la solución 0,105 mM cyt. C a 3500 l, la concentración c cyt. Ahora en el sol es, en teoría, 15 mM. Pipetear 0,5 ml de la resultante cyt. Sol de sílice c en cada molde preparado. También pipetear 0,5 ml de permanecer 'normal' sol de sílice en una o dos moldes para su uso como muestras de control durante el proceso de secado supercrítico. Cubrir las aberturas cara arriba de los moldes con Parafilm y poner en el refrigerador (~ 2-8 ° C) durante la noche o durante al menos 12 horas para producir sol-gel. Tome los moldes de la nevera. Retire el Parafilm desde lo alto de un molde que contiene un cyt c sol-gel.; También retire la tapa y una envoltura de plástico de la parte inferior. Después de la adición de un poco de etanol a partir de una botella de lavado en el molde, utilice el extremo de disco circular de un émbolo de jeringa para empujar cuidadosamente el gel del molde y en una limpieza 20 ml cont vial de centelleo de vidrioaining aproximadamente 5 ml de etanol. Repita este procedimiento de extracción de gel (pasos 4.5 y 4.6) hasta que todo el cyt. Geles c se añaden al vial y todos los geles de sílice se añaden a un vial separado. Si se ha hecho más de una concentración de gel de cyt c., Asegúrese de guardarlo como geles juntos dentro de viales separados. A continuación, llenar los viales a la cima con etanol, la tapa y almacenar entre 2-8 ° C. Cada cuatro horas durante el día, eliminar los geles de la nevera, se decanta el etanol fuera de los geles y se reemplazan con etanol fresco. Durante un período adicional de tres días, sumergir los geles húmedos sol en acetona, la decantación y la adición de acetona fresca tres veces al día. 5. supercríticamente Cit seco. C -silica Sol-geles Enfriar un aparato de punto de secado crítico (véase la Figura 1) a 10 ° C mediante el establecimiento de la temperatura de un termostato conectado a 8 ° C. Una vez que el aparato tiene reached 10 ° C, lleve a cabo una prueba de fugas en el aparato llenando un barco de transporte con acetona y sellándolo en el interior del aparato. Abra la válvula de llenado del aparato y añadir dióxido de carbono hasta que el aparato está medio lleno. Cierre la válvula de llenado y escuchar atentamente para sibilante en las puertas y válvulas, donde las juntas tóricas o los sellos pueden estar deteriorándose. Reemplazar cualquier juntas tóricas o los sellos si se detecta una fuga. Después de completar la prueba de fugas, abra la válvula de drenaje para liberar la acetona y el dióxido de carbono en el desagüe de una campana de humos. A continuación, retire el barco de transporte del aparato. Después de asegurarse de que el aparato está libre de fugas, se vierte cuidadosamente los geles húmedos de los viales de centelleo, junto con la mayor parte de la acetona, en tres secciones largas de la embarcación de transferencia (cestas de muestras o cubiertas de gasa no son necesarios). Delicadamente empujar y mover los geles dentro de la embarcación con una pinza para asegurar que todos los geles i se sumergen completamenten acetona. Añadir más acetona si es necesario antes de sellar el bote dentro del aparato. Abrir la válvula de llenado del aparato de añadir dióxido de carbono, a continuación, abrir la válvula de drenaje para liberar acetona durante cinco minutos tan pronto como se observe la mezcla con el dióxido de carbono acetona para hundirse a la parte inferior del aparato a través de la ventana aparato. Este filtrándose de la acetona a la parte inferior se producirá antes de que el aparato está completamente lleno de dióxido de carbono, por lo que la válvula de llenado debe permanecer abierta en la medida necesaria durante el vaciado de manera que el aparato continuará para llenar incluso mientras el drenaje está abierta. Cierre la válvula de drenaje. Mantenga la válvula de llenado agrietada abierta ligeramente. Cinco minutos más tarde, abrir la válvula de drenaje durante cinco minutos de nuevo y ajustar la válvula de llenado para ser abierto lo suficiente para que el aparato permanece lleno durante todo el tiempo de drenaje. Cierre la válvula de drenaje, mantener la válvula de llenado resquebrajó, a continuación, repetir este paso de drenaje una vez más de cincominutos más tarde. Después de estos tres primeros pasos de drenaje, abrir el desagüe durante 5 minutos a una hora aproximadamente cada 40 min en el lapso de al menos seis horas para asegurar la sustitución completa de acetona por el dióxido de carbono líquido dentro de los geles. Siempre ajuste la válvula de llenado de estar abierto lo suficiente durante cada drenaje de modo que el nivel de líquido en el aparato nunca cae por debajo de la parte superior del barco durante el drenaje. Una vez que los pasos de drenaje hayan terminado, cierre la válvula de llenado, y drene el dióxido de carbono líquido, de manera que el nivel permanece visible justo por encima de los dientes en el barco mirando a través de la ventana del aparato. Ajuste la temperatura del termostato adjunta aparato a 40 ° C para asegurar que los aumentos de dióxido de carbono líquido por encima de su temperatura crítica y la presión (Tc = 31 ° C; P c = 7,4 MPa). Después de aproximadamente 15 min, observar la transición de líquido a fluido supercrítico a través de la ventana aparato como el líquido meniscnosotros por encima de las púas del barco desaparece. Deje por lo menos 15 minutos de tiempo de equilibrio, a continuación, abra la válvula de purga una pequeña cantidad para comenzar a liberar el fluido supercrítico. En el transcurso de aproximadamente 45 min, seguir abriendo progresivamente la válvula de ventilación más y más de modo que un silbido constante, pero muy bajo de líquido de liberación puede ser oído y se observa el indicador de presión para disminuir lentamente a cero. Después de que la presión del aparato se ha ido a cero, abrir la puerta de aparato, retire el barco, y el uso de fórceps para colocar los aerogeles recién secos en viales de centelleo de vidrio limpio. 6. Caracterizar Cit. C -silica aerogeles con UV-visible y dicroísmo circular (CD) Espectroscopia Preparar una plataforma de cartón para contener los monolitos de aerogel en la trayectoria del haz del espectrofotómetro o CD espectrómetro UV-Visible. Cortar un trozo de 2,5 cm x 2,5 cm de cartón ligero (tal como cartón de una caja de labotejido ratorio), doblar por la mitad, cortado a media altura en el pliegue, luego doblar las dos solapas, creados por el corte, hacia atrás. Cortar un 5 cm x 5 cm pedazo de cartón ligero, con un orificio de 1,5 cm x 1,5 cm cuadrado en el centro. A continuación, utilice cinta aislante negro para disminuir el tamaño de la bodega de 0,5 cm x 0,5 cm. Cinta de las solapas del cartón plegado y corte contra la pieza de 5 cm x 5 cm de cartón de manera que se crea una pequeña superficie curvada para un monolito de aerogel para sentarse directamente delante del orificio de 0,5 cm x 0,5 cm (véase la Figura 2) . A continuación, pegue la pieza de la espalda de cartón para el espectrofotómetro UV-visible por lo que el agujero está en línea con la trayectoria del haz. Medir el espesor de los geles, que se utilizarán para longitudes de trayectoria, con un micrómetro. Coloque un gel en la plataforma de cartón y medir un espectro de 300 a 800 nm con el aire en el compartimiento de referencia del espectrofotómetro UV-visible. Montar un polinomio, A = a </em> λ n, a la región de longitud de onda (λ), donde la absorbancia (A) se debe principalmente a fondo la dispersión, ~ 700-800 nm. El coeficiente de ajuste es típicamente a un número entre ~ 1 x 10 8 y 1 x 10 6 y el coeficiente de n es típicamente en forma de un número entre 2 y 3 ~. Calcular la dispersión en otras longitudes de onda, utilizando los coeficientes, a y n, que se obtiene a partir del ajuste. Restar este calculado absorbancia de fondo de dispersión del espectro bruto para obtener un espectro de dispersión corregido. Montar el espectro de dispersión resta con una curva de Gauss en la región de 370 a 490 nm usando el software apropiado (gramos / AI 8,0) para determinar la altura del pico, centro del pico, y la anchura de pico del pico Soret del aerogel. Aplicar la Ley de Beer-Lambert utilizando los espesores medidos del gel para la longitud del trayecto (l), el coeficiente de extinción 31 (ε) de 106.100 M -1 cm -1 </sup> y la altura del pico Soret (A) para calcular la concentración (c) de cyt. c en el aerogel (A = εlc). Comparar el cyt calculado. Concentración c a la concentración teóricamente en el gel (15 M) para determinar la viabilidad de cyt. C dentro del aerogel. Por ciento viabilidades típicos son cercanas al 100%, pero debe tenerse en cuenta que estas viabilidades son sólo estimaciones debido a que el cálculo se basa en el coeficiente de extinción de cyt. C en solución 31 que se presume que es un poco diferente que el coeficiente de extinción de cyt. c en los aerogeles que no se conoce. nitrógeno ejecutar en el instrumento CD de al menos 5 minutos antes de encender la lámpara. Tape el soporte de cartón al espectrómetro de CD de modo que el agujero está en línea con la trayectoria del haz. Medir un espectro de longitudes de onda continua en blanco sin nada en el soporte de cartón de 350-500 nm a 100 nm / min, teniendo un promedio de tres exploraciones. Coloque un gel (espesor medido previamente en el paso 6.2) en la plataforma de cartón y medir un espectro que va desde 350-500 nm a 100 nm / min, teniendo un promedio de tres exploraciones. Repetir las mediciones UV-visible y CD para todos los monolitos de aerogel de interés. 7. detectar la presencia de gas óxido nítrico (NO) con Cit. C -silica aerogeles PRECAUCIÓN: El trabajo con el NO es peligroso y todo el gas NO debe ser manejado en una campana de humos o agotada en una campana de humos. La exposición sostenida a NO es tóxico para los tejidos como dióxido de nitrógeno altamente venenoso y / o tetróxido de nitrógeno formará cuando NO entra en contacto con el aire. Calor y corrosivos humos también se producen cuando NO entra en contacto con agua. Coloque un cilindro de óxido nítrico 8 L (óxido de nítrico al 10%, el 90% de nitrógeno) en una campana extractora bien ventilada y ajustar la presión a 4 psi. Conectar los tubos a tanto el cilindro de óxido nítrico y a un cilindro de nitrógeno (presión ajustado a 6 psi) y enlazar los extremos de la tubería a una válvula en T (véase la figura 3a). Elija un monolito aerogel para el experimento y medir el espesor (o longitud de la trayectoria) con un micrómetro. Coloque el aerogel (~ 3 mm de espesor) en una cubeta desechable con tapa de plástico y poner la cubeta en el espectrofotómetro. Cortar el aerogel ligeramente si es necesario para adaptarse a la cubeta. Insertar dos agujas de jeringa en el tapón de plástico de la cubeta, uno conectado a la salida de la válvula en T, y una conectada a un tubo para servir como escape en la campana de humos (véase la figura 3b). Use Parafilm para sellar las agujas para el tubo y el tapón a la cubeta. Coloque una cubeta desechable vacío en la celda de referencia. Ajustar la posición de cubeta aerogel para asegurar que el aerogel está en la trayectoria del haz antes de iniciar el experimento. Tomar un espectro inicial 800-300 nm. Monitorear la diferencia entre la absorbancia a 414 nm y la absorbancia a 408 nm mientras se gira la válvula en T para cambiar entre nitrógeno y la mezcla de óxido nítrico / nitrógeno a intervalos de tiempo establecidos asegurándose de que en ningún momento es la tasa de flujo de nitrógeno o de la mezcla de óxido nítrico / nitrógeno tan alta que el aerogel se mueve en la cubeta. Tome un espectro final a partir de 800 a 300 nm, una vez que los ciclos de exposición están acabados. Repetir el procedimiento con tres a cuatro monolitos para obtener una respuesta promedio de detección.