JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

encapsulating ציטוכרום<em> ג</em> ב סיליקה אירוג'ל Nanoarchitectures ללא מתכת חלקיקים תוך שמירת גז שלב פעילות ביולוגית

Published: March 01, 2016
doi:
10.3791/53802
, ,
1Department of Chemistry & Biochemistry,Fairfield University

Summary

הליך זה מתאר כיצד לתמצת ציטוכרום C (CYT. ג) סיליקה (SiO 2) סול ג'ל, תהליך ג'לים אלה כדי ליצור bioaerogels, ולהשתמש bioaerogels אלה להכיר תחמוצת החנקן במהירות (NO) באמצעות תגובה גז פאזיים. סוג זה של פרוטוקול עשוי לסייע בפיתוח העתידי של חיישנים ביולוגיים או מכשירי bioanalytical אחרים.

Abstract

יישומים כגון חיישנים, סוללות ותאי דלק שופרו באמצעות aerogels הנקבובי ביותר כאשר תרכובות פונקציונליות כמוסות בתוך aerogels. עם זאת, כמה דיווחים על encapsulating חלבונים בתוך-ג'לים סול המעובדים לגבש aerogels להתקיים. הליך עבור encapsulating ציטוכרום C (CYT. ג) סיליקה (SiO 2)-ג'לים סול המעובדים supercritically לגבש bioaerogels עם פעילות פאזיים גז תחמוצת החנקן (NO) מוצג. CYT. ג מתווסף סול סיליקה מעורב תחת ריכוז חלבון מבוקר חיץ תנאי כוח. תערובת הסול בג'ל אז הנוזל ממלא את הנקבוביות ג'ל מוחלף באמצעות סדרה של חילופי ממס עם פחמן דו חמצני נוזלי. פחמן דו חמצני הוא הביא הנקודה הקריטית שלה פרק את טופס aerogels היבש עם CYT. ג כמוס בפנים. bioaerogels אלו מאופיינים עם ספקטרוסקופיה UV- גלויספקטרוסקופיה dichroism מעגלית ד וניתן להשתמש בו כדי לזהות נוכחות של תחמוצת החנקן פאזיים גז. ההצלחה של הליך זה תלוי בוויסות CYT. ריכוז ג וריכוז חיץ ואינו דורש רכיבים אחרים כגון חלקיקי מתכת. ייתכן שניתן לתמצת חלבונים אחרים באמצעות גישה דומה ביצוע הליך זה חשוב לפיתוח מכשיר bioanalytical העתידי אפשרית.

Introduction

ציטוכרום C (CYT. ג) הוא חלבון אלקטרון-העברת המפתח המעורבים בתגובות הנשימה התאית של הגוף. זה הוכח להיות מעורב אפופטוזיס, צורה מבוקרת של מוות של תאים, והוא יכול לזהות מולקולות רעילות קטנות כגון תחמוצת חנקן ופחמן חד חמצני 1-3. תחמוצת החנקן (NO) משחק תפקיד במגוון תהליכים פיזיולוגיים המתרחשים העצבים, הלב וכלי הדם, והמערכת החיסונית. בעוד CYT. ג בדרך כלל דורש סביבה מימית שנאגרה לערכים ניטראליים pH להישאר שלמים מבניים ופעיל, מחקרים הוכיחו כי CYT. ג יכול לשמור על המבנה והתפקוד שלה חומרים מוצקים המכונים aerogels בתנאים מסוימים 4-9.

Aerogels הם חומרים נקבוביים מאוד לעתים קרובות נוצר על ידי סינתזה תחמוצות מתכת סול-ג'ל (בעוד aerogels תחמוצת מתכת נפוצים מאוד, פחמן וסוגים אחרים של aerogels היה מסונתז. דוגמה אחת היא InP AER ogels) 10 וייבוש סול ג 'ל אלו בצורה כזו כי מטריקס מוצק הנקבובי נותר ללא שינוי 11-14. כל הנקבוביות aerogels המוצק לגרום aerogels קבלת שטח פנים הרבה זמין מאוד שימושית עבור כל יישומים בם תגובות משטח חשובות. כאשר כימי או הפונקציונלי ביוכימי מורכב בתוך airgel nanoarchitecture, הוכיח כי נקבובי הפיסית שטח המשופר של aerogels לעזור לשפר חיישנים, כמו גם אלקטרודות עבור סוללה, תא דלק, ויישומי על 11,15-23 . על מנת לייבש aerogels בצורה שמשאירה את מטריקס מוצק נקבובי ללא שינוי, זה אופייני כדי להסיר את הממס שנותר בתוך הנקבוביות לאחר סינתזה סול ג'ל באמצעות מיצוי ממס סופר קריטי. כל קריסה נקבובית כי עלול להיגרם על ידי כוחות מתח פנים כמו מתאדה ממס מן הג'ל הן מזעריות כי ייבוש סופר קריטי, ממשק אד נוזל מעולם צורות.

<p class="jove_content"> ישנם דיווחים רבים של חלבוני heme כגון CYT. ג להיות גלומים-ג'לי סול כי נשמרו רטוב או כי כבר מיובש ambiently 24-30. דוחות של ביומולקולות encapsulating ב-ג'לים סול כי אז הם יבשים supercritically לגבש aerogels נדירות בשל עיבוד הכרחי שיכולים להזיק את המבנה של חלבונים רבים. במקרה של CYT. ג, בתנאים מסוימים מאפשרים לשמור על היכולת של CYT. ג כדי לזהות ולהגיב תחמוצת החנקן פאזיים גז בתוך aerogels. לאחר התייצבתי airgel, המבנה הנקבובי באיכות הגבוהה של airgel מקל על התגובה בין CYT. ג ו 4,8,9 תחמוצת חנקן. CYT. ג ניתן כמוס בתוך aerogels ידי שיוכו הראשון בשכבות מרובות סביב חלקיקי זהב או כסף בתמיסת 4-8. על רב שכבתי אלו משמשים כדי להגן על החלבון בתוך מטריצת airgel. בשנות ה approac האחרונהh שפתחנו, כאשר ריכוז חלבון חיץ הכח נשלטים יחד עם תנאים סינטטיים אחרים, CYT. ג שומרת שלמות בתוך aerogels גם ללא חיבור הראשון nanoparticle מתכת 9.

הסינתזה מתחילה סינתזות airgel רבות להתחיל על ידי ערבוב סיליקה מבשר סול ג 'לתקופה קצובה של זמן. זה אחרי סט ערבוב זמן כי CYT. ג מתווסף כפתרון שנאגר לתוך התערובת. Gelation ואז מתרחש ליצור מבנה מוצק סיליקה נקבובי שבו הנקבוביים מלאים מים, מתנול, מגיבים ומוצרי לוואי נותרים. נוזל זה שממלא את הנקבוביות ניתן לשטוף החוצה עם ממסים שונים באמצעות סדרה של חילופי ממס, הבורסות האחרונות עם פחמן דו חמצני נוזלים המתרחשים בתוך מנגנון ייבוש נקודה קריטי שמרו בטמפרטורה נמוכה. הביא את הג'לים מעל לטמפרטורה הקריטית (31.1 מעלות צלזיוס) של פחמן דו חמצני הופך לפשוט היווצרות כמונוזל upercritical בתוך המנגנון בלחץ שניתן פרק לטופס יבש, aerogels הנקבובי ביותר. הטמפרטורה הנמוכה יחסית הדרושים פחמן דו חמצני כדי ליצור לנוזל סופר יש יתרון לעומת ממיסים אחרים כי זה שומר את החלבון מתחת לטמפרטורה שבה הוא יכול לפגל.

הגישה ננו-חלקיקים ללא מתכת שלנו encapsulating CYT. ג ב aerogels יש יתרון משום שהוא הוא הליך פשוט שעשויים להוביל לפיתוח של פרוטוקול החלים באופן כללי יותר עבור encapsulating חלבונים אחרים גם כן. חלבונים רבים אולי לא אינטראקציה עם חלקיקי מתכת באותה דרך כי CYT. ג עושה סינתזה nanoparticle מתכת או רכישה מוסיף זמן נוסף והוצאות ההליך. המעטים דיווחים על encapsulating החלבונים aerogels להפוך את הפיתוח של הליך זה צעד משמעותי קדימה למציאת נוהל כללי יותר עבור encapsulating חלבונים אחרים aerogels שעשוי לסייע iהתקני bioanalytical פוטנציאל עתידיים n.

באזור פרוטוקול של כתב היד הזה מתאר איך לסנתז סול ג'ל סיליקה, לתמצת CYT. ג לג'ל-סול אלה, לייבש-ג'לים סול מרוכבים אלה כדי ליצור aerogels, לאפיין bioaerogels אלה באמצעות UV- גלוי והחוזר ספקטרוסקופיה dichroism ו לזהות נוכחות תחמוצת החנקן פאזיים גז עם bioaerogels אלה. CYT. ג כבר כמוס בהצלחה aerogels כאשר מומס הראשון בתמיסות מימיות 4.4 כדי 70 מ"מ של חיץ פוספט. עם זאת, מבנה החלבון אופטימיזציה aerogels נמצאה התוצאה כאשר encapsulating 40 מ"מ פוספט פתרונות שנאגרו של CYT. ג הפקת טעון airgel CYT. ריכוזים ג בטווח של 5 עד 15 מיקרומטר 9. לכן, בפרוטוקול כדלקמן היא לסנתז aerogels באמצעות פתרונות שנאגרו פוספט 40 מ"מ של CYT. ג וכתוצאה מכך CYT טעון. ריכוז ג ב aerogels של 15 מיקרומטר. </ P>

Protocol

בטיחות משקפיים או משקפי מגן, מעיל מעבדה, וכפפות מעבדה צריך להיות משוחק בכל עת במהלך ההליך. אין להפעיל את מנגנון ייבוש נקודה הקריטי ללא משקפי מגן או משקפים. כל תמיסות המכילות tetramethoxysilane, מתנול, אתנול, אצטון, ואמוניה אמורה להתבצע בתוך במנדף. 1. הפוך הצפת CYT. פתרונות ג כדי להפוך ~ 750 מ"ל של pH 7, 40 מ"מ חיץ פוספט אשלגן, תחילה להכין 500 מ"ל של 0.04 monobasic פוספט M אשלגן בשקילה החוצה 2.72 גרם של monobasic פוספט אשלגן והמסה במים באמצעות בקבוק מדידה 500 מ"ל. הכן 500 מ"ל של dibasic פוספט 0.04 M אשלגן בשקילה החוצה 3.48 גרם של dibasic פוספט אשלגן והמסה במים באמצעות בקבוק מדידה 500 מ"ל. יוצקים את תמיסת מלח dibasic לתוך מבחנה גדולה עם בר ומערבבים ומתחיל לבחוש הפתרון בצלחת ומערבבים. לאט לאט להוסיף חלקים של מלח monobasic solution לפתרון מלח dibasic תוך ניטור pH עם האלקטרודה מטר pH עד pH הוא 7.00. כ 250-300 מ"ל של תמיסת מלח monobasic ישמש. תשקול כ 0.023 גרם של CYT. ג ומכניסים בקבוקון נצנץ זכוכית. להוסיף 2,000 μl של חיץ פוספט אשלגן מוכן באמצעות micropipette ואז בעדינות מערבולת הפתרון לערבב עד שכל CYT המוצק, אדום. ג נמס לתוך התמיסה ולא חומר חלקיקים נשאר. קח 20 μl של פתרון CYT. ג מוכן ולהוסיף קובט פלסטיק אורך מסלול 1 ס"מ. הוסף 3 מ"ל של חיץ מוכן. קח ספקטרום UV-VIS מן 300-700 ננומטר באמצעות חיץ בתא התייחסות. השתמש CYT. ג ספיגת (א) ב 409 ננומטר, מקדם הכחדה 31 (ε) של 106,100 M -1 ס"מ -1, את אורך הדרך קובט (L), ואת חוק בר-למברט לקביעת ריכוז (ג) של הפתרון (A = εlc). חזרה לחשב את הריכוז של הפתרון המוכן המקורי. 2 מ"ל מוכן CYT. פתרון ג הוא בדרך כלל בין 0.7 כדי 0.9 מ"מ בריכוז. לדלל את CYT מוכן המקורי. פתרון ג עד 800 μl של 0.105 מ"מ על ידי pipetting 117 μl של 0.72 מ"מ מוכן CYT. פתרון ג לתוך בקבוקון הנצנץ. לאחר מכן מוסיפים את יתרת 800 μl (683 μl במקרה זה) של חיץ מוכן. מערבולת לערבב. הכרכים המדויקים משתנים בהתאם הריכוז המדויק של CYT המוכן המקורי. פתרון ג כנפח CYT. ג pipet מחושבת (800 μl * 0.105 מ"מ) / (CYT המקורי. ריכוז ג מ"מ). אחסן CYT מוכן ומדולל המקורי. פתרונות ג ב 2-8 מעלות צלזיוס במקרר עד מוכן לשימוש עד שבועיים. 2. לסנתז סיליקה (SiO 2) סול לייבל מבחנת פוליפרופילן פנויה 50 מיליליטר "Beאקר א '. מניחים כוס על מחבת של איזון אנליטיים להשתמש פיפטה פסטר זכוכית להוסיף tetramethoxysilane 1.88 גרם לתוך כוס. אפס האיזון ואז פיפטה 2.88 גרם של מתנול לתוך 'מבחנה'. "המבחנה" כסה Parafilm. לייבל מבחנת פוליפרופילן פנוי 50 מיליליטר "Beaker ב '. הוספת בר ומערבבים מגנטי ומניחים על המחבת של איזון אנליטית. השתמש פיפטה זכוכית להוסיף מים 0.75 גרם ו 3.00 מתנול גרם. Cover 'Beaker B' עם Parafilm. בגין בחש 'Beaker ב' בצלחת ומערבבים בתוך במנדף, ואז להשתמש במזרק כדי להוסיף 5 μl של פתרון אמוניום הידרוקסיד 28.0-30.0% באמצעות Parafilm לכסות לתוך התערובת תוך ערבוב. ברגע שלב 2.5 יושלם, להוסיף את התוכן של "מבחנה 'ל' Beaker ב '. מערבבים את התערובת במשך 20 דקות תוך מכוסה Parafilm. 3. להכין ג'ל תבניות הערה: ישזמן להכין את התבניות ג'ל בעוד תערובת סול סיליקה בוחשת בשלב 2.6. רוכש בקבוקוני נצנץ פוליפרופילן 8-9 (16 מ"מ x 57 מ"מ, 6.5 מיליליטר גודל נפח, עם תחתית נחתכה) וכובעים מקבילים. שים בניילון נצמד מעל הקצה המכסה של הבקבוקון כדי ליצור משטח שטוח עבור הג'ל על מנת ליצור על ולמקם את הכובע על זה ולוודא כי בניילון הנצמד נשאר ללא פגע בתוך הכובע. בשורת הצלוחיות עם סוף הכובע למטה על גבי הספסל ופתח תחתי פונה כלפי מעלה. 4. כן CYT. ג -silica סול-ג'ל עם השלמת סול ערבוב (שלב 2.6), להוסיף 3 מ"ל של תערובת סול מבחנה הפנויה 50 מ"ל פוליפרופילן נקי. השתמש פיפטה זכוכית פסטר לרדת לאט 500 μl של 0.105 מ"מ בדילול CYT. פתרון ג (עשה צעד 1.9) לתערובת סול 3 מ"ל במשך ~ 1 דק '. הקפד מערבולת את התערובת בעדינות תוך הוספת CYT. ג כדי למנוע היווצרות של גדוליםגושים אדומים. בהנחה הכרכים הם כתוסף, על ידי דילול 500 μl של פתרון ג 0.105 מ"מ CYT. ל -3,500 μl, את CYT ריכוז ג. כעת סול הוא, בתיאוריה, 15 מיקרומטר. Pipet 0.5 מ"ל של CYT. ג סיליקה סול שנוצר לתוך כל עובש מוכן. כמו כן pipet 0.5 מ"ל של הנותרים 'רגיל' סיליקה סול לתוך תבניות אחד או שניים כדי להשתמש כמו דגימות בקרה במהלך תהליך הייבוש סופר קריטי. אין לכסות את הפתחים כלפי מעלה של תבניות עם Parafilm ולשים במקרר (~ 2-8 ° C) לילה או לפחות 12 שעות כדי לייצר-ג'לים סול. קח את התבניות מהמקרר. הסר את Parafilm מהחלק העליון של עובש אחד המכיל CYT ג-ג 'ל- Sol.; גם להסיר את הכובע בניילון נצמד מלמטה. לאחר הוסיף כמה אתנול מבקבוק לשטוף לתוך התבנית, להשתמש סוף הדיסק העגול של בוכנת מזרק כדי לדחוף את הג'ל בזהירות מתוך התבנית ולתוך המשך בקבוקון נצנץ זכוכית נקי 20 מיליליטרaining כ 5 מ"ל של אתנול. חזור על הליך הסרת ג'ל זה (שלבים 4.5 ו -4.6) עד שכל CYT. ג'לים ג מתווספים בקבוקון וכל הג'לים סיליקה מתווספים בקבוקון נפרד. אם יש יותר ריכוז אחד CYT. ג'ל ג נעשה, הקפד לאחסן כמו ג'לים יחד בתוך מבחנות נפרדות. לאחר מכן ממלאים צלוחיות לפסגה עם אתנול, כובע ולאחסן בין 2-8 מעלות צלזיוס. כל ארבע שעות במשך היום, להסיר את הג'לים מהמקררים, למזוג אתנול את הג'לים ולהחליף עם אתנול טרי. במהלך השלושה ימים נוספים, להטביע את הג'לים סול הרטובים אצטון, decanting והוסיף אצטון טרי שלוש פעמים ביום. 5. Supercritically יבש CYT. ג -silica סול-ג'ל מגניבי מנגנון ייבוש נקודה קריטי (ראה איור 1) עד 10 ° C על ידי קביעת הטמפרטורה של circulator מצורפת 8 מעלות צלזיוס. לאחר המנגנון יש reached 10 ° C, לבצע בדיקת דליפה על המנגנון על ידי מילוי סירת העברה עם אצטון ואיטום זה פנימי של המכשיר. פתח את שסתום המילוי של המנגנון ולהוסיף פחמן דו חמצני עד המנגנון הוא חצי מלא. סגור את שסתום המילוי ולהקשיב בתשומת לב עבור השורק לעומת הדלתות שסתום שם טבעות אטימות או חותמות ניתן המידרדר. חלף כל טבעות אטימות או חותמות אם נמצאה דליפה. לאחר השלמת הבדיקה דליפה, פתח את שסתום הניקוז לשחרר אצטון ודו תחמוצת הפחמן לתוך פתח הניקוז של במנדף. ואז להסיר את סירת ההעברה מן המנגנון. לאחר שווידאת כי המנגנון הוא דליפה ללא, ובזהירות לשפוך את הג'לים הרטוב מן בקבוקוני הנצנץ, יחד עם רוב של אצטון, לתוך הקטעים ארוכים השלושה של סירת ההעברה (סלי דגימה או מכסת גזה אינם נחוצים). בעדינות לדחוף ולהזיז את הג'לים בתוך סירה עם מלקחיים כדי להבטיח שכל ג'לים שקוע לחלוטין iאצטון n. הוסף עוד אצטון במידת הצורך לפני שהוא סגר את הסירה הפנימי של המכשיר. פתח את שסתום המילוי של מנגנון להוסיף פחמן דו חמצני, ולאחר מכן פתח את שסתום הניקוז לשחרר אצטון במשך חמש דקות בהקדם אצטון ערבוב עם פחמן דו חמצני הוא ציין להיות שוקע לתחתית של המנגנון מבעד לחלון המנגנון. מחלחל זה של אצטון לתחתית יתרחש לפני במנגנון מלא לחלוטין עם פחמן דו חמצני, כך שסתום המילוי צריך להישאר פתוח במידת הצורך במהלך הניקוז כך שהמנגנון ימשיך למלא אפילו תוך לטמיון פתוח. סגור את שסתום הניקוז. שמור את שסתום המילוי ייפרץ מעט. חמש דקות לאחר מכן, פתח את שסתום הניקוז במשך חמש דקות שוב ולהתאים את שסתום המילוי להיפתח מספיק כך המנגנון נשאר מלא בזמן הניקוז כולו. סגור את שסתום הניקוז, לשמור על שסתום המילוי ייפרץ, ואז לחזור על זה צעד ניקוז עוד פעם אחת חמשדקות מאוחר יותר. בעקבות שלושה שלבי הניקוז הראשונים, פתח את הבריחה במשך 5 דקות בכל פעם בערך כל 40 דקות במשך התקופה של לפחות שש שעות כדי להבטיח תחליף מלא של אצטון על ידי דו תחמוצת הפחמן נוזלית בתוך ג'ל. תמיד להתאים את שסתום המילוי להיות פתוח מספיק במהלך כל ניקוז כך רמת הנוזל במנגנון לא יורדת מתחת העליונה של הספינה במהלך ניקוז. לאחר שאבצע שלבי ניקוז הושלמו, לסגור את שסתום המילוי, ומסנן את דו תחמוצת הפחמן הנוזלית כך שהרמה תישאר גלויה בדיוק מעל החוד על הספינה על ידי הסתכלות דרך חלון המנגנון. הגדר את הטמפרטורה של circulator המנגנון המצורף 40 ° C על מנת להבטיח כי העליות דו תחמוצת הפחמן הנוזלית מעל הטמפרטורה ולחץ הקריטי שלה (ג T = 31 ° C; ג P = 7.4 MPA). לאחר כ 15 דקות, להתבונן במעבר מנוזל לנוזל סופר מבעד לחלון המנגנון כמו menisc הנוזללנו מעל החוד של הסירה נעלם. אפשר לפחות 15 דקות של זמן איזון, ולאחר מכן פתחו את שסתום אוורור כמות קטנה כדי להתחיל לשחרר את לנוזל סופר. במהלך 45 דקות בערך, ממשיכים לפתוח את שסתום האוורור באופן הדרגתי והתרחב כך שבריקה יציבה, אבל נמוכה מאוד של נוזל שחרור ניתן לשמוע ואת מד הלחץ הוא ציין להקטין לאפס לאט. אחרי הלחץ של המנגנון הלך לאפס, פתח את דלת המנגנון, להסיר את הסירה, להשתמש במלקחיים כדי למקם את aerogels יבשים החדשים צלוחיות נצנץ זכוכית נקיות. 6. לאפיין CYT. ג -silica Aerogels עם גלוי-UV ומתאר dichroism (CD) ספקטרוסקופיה הכן פלטפורמה קרטון להחזיק את הפסלים airgel בנתיב קרן של ספקטרומטר CD או ספקטרופוטומטר גלוי-UV. לגזור חתיכת 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ קרטון קל (כגון קרטון מקופסת laboרקמת במעבדתו), קפל אותה לשניים, לחתוך בחצי הגובה על פי, ואז לקפל את שני דשי, נוצר על ידי חיתוך, בחזרה. לגזור חתיכת 5 ס"מ x 5 ס"מ קרטון קל משקל, עם חור 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ מרובע באמצע. לאחר מכן השתמש הקלטת חשמל שחור כדי להקטין את גודל בהמתנה 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ. סרט דשי של הקרטון לחתוך נגד פיסת 5 ס"מ x 5 ס"מ קרטון כך משטח כפוף קטן נוצר עבור מונולית airgel לשבת על ישירות מול חור 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ (ראה איור 2) . ואז להקליט את הכלי בחזרה קרטון אל ספקטרופוטומטר UV- גלוי ולכן החור עולה בקנה אחד עם נתיב קרן. מדוד את העובי של ג'לים, אשר ישמש עבור אורכי נתיב, עם מיקרומטר. מניחים ג'ל על המשטח קרטון ולמדוד קשת הגוונים בין 300-800 ננומטר עם האוויר בתא ההתייחסות של ספקטרופוטומטר UV- גלוי. להתאים פולינום, A = </em> λ n, לאזור אורך הגל (λ) שבו ספיגת (א) נובע בעיקר פיזור רקע, ~ 700-800 ננומטר. א מקדם הוא בדרך כלל לנכון מספר בין ~ 1 x 10 8 ו 1 x 10 6 ואת מקדם n הוא בדרך כלל לנכון מספר בין ~ 2 ו -3. חשב את פיזור באורכי גל אחרים, בעזרת המקדמים, a ו- n, המתקבל לנכון. הפחת ספיגת רקע פיזור מחושב זה מהספקטרום גלם להשיג ספקטרום תיקן פיזור. התאם את הספקטרום מופחת פיזור עם עקומת גאוס באזור של 370 עד 490 ננומטר באמצעות תוכנה מתאימה (גרם / AI 8.0) כדי לקבוע את גובה השיא, מרכז שיא, ורוחב שיא של שיא Soret של airgel. החל את חוק בר-למברט באמצעות עובי המדוד של ג'ל אורך הדרך (L), מקדם הכחדה 31 (ε) של 106,100 M -1 cm -1 </sup> ואת גובה שיא Soret (א) כדי לחשב את ריכוז (ג) של CYT ג. ב airgel (A = εlc). השווה את CYT מחושב. ריכוז ג לריכוז תיאורטית בתוך הג'ל (15 מיקרומטר) כדי לברר את הכדאיות של CYT. ג בתוך airgel. Viabilities אחוזים אופייניים הם קרוב ל -100%, אך יש לציין כי viabilities אלה הם רק הערכות כי החישוב מבוסס על מקדם הכחדה של CYT. ג בתמיסה 31 אשר חזקה כי מעט שונה מאשר מקדם הכחדה של CYT. ג ב aerogels שאינו ידוע. חנקן הפעל במכשיר CD לפחות 5 דקות לפני הדלקת המנורה על. קלטתי את בעל הקרטון אל ספקטרומטר CD ולכן החור עולה בקנה אחד עם נתיב הקרן. מדוד ספקטרום ריק גל מתמשך עם שום דבר בעל הקרטון של 350-500 ננומטר ב 100 ננומטר / דקה, לוקח בממוצע שלוש סריקות. מניחים ג'ל אחד (עובי נמדד קודם לכן בשלב 6.2) בפלטפורמת קרטון ולמדוד קשת הגוונים בין 350-500 ננומטר ב 100 ננומטר / דקה, לוקח בממוצע שלוש סריקות. חזור על מדידות UV- גלוי ו- CD לכל מונוליתים airgel עניין. 7. זיהוי נוכחות של Nitric Oxide (NO) גז עם CYT. ג -silica Aerogels זהירות: עבודה עם NO מסוכן וכל אין גז יש לטפל במנדף או מותש אל במנדף. חשיפה מתמשכת ל NO היא רעילה רקמות כפי מאוד תחמוצת חנקן רעילה ו / או tetroxide חנקן תהווה כשאף באים במגע עם אוויר. אדי חום ומאכל מיוצרים גם כשאף בא במגע עם מים. מניח גליל תחמוצת 8 L חנקתית (10% תחמוצת חנקן, 90% חנקן) במנדף מאוורר היטב ולהתאים את הלחץ עד 4 psi. חיבור צינורות לשני צילינדר תחמוצת חנקן כדי גליל חנקן (לחץ המוגדר כ -6 psi) ולקשר את הקצוות של צינורות אל T-שסתום (ראה איור 3 א). בחר מונולית airgel לניסוי ולמדוד את עובי (או אורך הדרך) עם מיקרומטר. מניח את airgel (~ 3 מ"מ עובי) ב קובט חד פעמי עם מכסה פלסטיק ולשים קובט לתוך ספקטרופוטומטר. חותכים את airgel מעט במידת הצורך להשתלב קובט. הכנס שתי מחטי מזרק לתוך מכסה הפלסטיק של קובט, אחד מחובר הפלט של שסתום T, ואחד מחובר לצינור לשמש פליטה לתוך במנדף (ראה איור 3 ב). השתמש Parafilm לאטום את המחטים אל הצינורות ואת הכובע כדי קובט. הוסף קובט הפנויה ריק בתא התייחסות. לשנות את מיקום קובט airgel מנת להבטיח כי airgel טמון נתיב קרן לפני תחילת הניסוי. קח ספקטרום ראשוני מ 800 כדי 300 ננומטר. צג את ההבדל בין הספיגה ב 414 ננומטר את הספיגה ב 408 ננומטר תוך כדי סיבוב שסתום T כדי לעבור בין חנקן ואת תערובת תחמוצת / חנקן החנקן במרווחי זמן מוגדר ולוודא כי בכל עת הוא קצב הזרימה של חנקן או תחמוצת חנקן / תערובת חנקן גבוה כל כך airgel נע סביב קובט. קח קשת סופית 800 כדי 300 ננומטר, כאשר מחזורי החשיפה שיסיימו. חזור על התהליך עם שלושה עד ארבעה מונוליתים להשיג תגובת חישה ממוצעת.

Representative Results

תוצאות ההליך המתואר aerogels המכיל CYT קיימא. ג. כפי שצוין בסוף המבוא, CYT. ג יכול להיות במארז מפתרונות חיץ מימיים אשר נעו בין 4.4 כדי 70 פוספט מ"מ. דוגמאות CYT. ג -silica (CYT. ג -SiO 2) aerogels עשוי תמיסות המכילות ריכוזי חיץ שונים מוצגים באיור 4. כל ג'ל שקוף יחסית, עם ג'ל עשוי 70 מ"מ למאגר האטום ביותר. מהשוואה בספקטרוסקופיה של CYT. ג בתנאים שונים מוצגת באיור 5. ספקטרום אופייני (5c איור) מראה את שיא Soret הגדול סביב 408 ננומטר עבור CYT. ג -SiO 2 aerogels והוא דומה מאוד לספקטרום CYT . ג בתמיסה (איור 5 א). בנוסף, מגוון של CYT.ג הכמוס בתוך aerogels עם חלקיקי מתכת מוצג גם (איור 5 ב ') ואת CYT. ג -SiO 2 קשת airgel דומה הספקטרום הזה גם כן. כאשר CYT. ג -SiO 2 airgel חשופה תחמוצת חנקן, הסטה אופיינית שיא Soret הוא ציין (5D איור). הספקטרום מול UV עבור ג'ל עשוי CYT. הפתרונים ג בריכוזי חיץ שונים מוצגים באיור 6. כל ג'לי אלה מראים ספקטרוסקופיות UV- גלוי מאפיין כולל מציין CYT. ג אינו במצב מפוגל בתוך ג'ל. עם זאת, את שקיפות הירידה של הג'לים עשויה 70 תוצאות חיץ מ"מ יחס אות לרעש נמוך יותר עבור ספקטרום אלה. ספקטרום CD של CYT. ג -SiO 2 aerogels דומה את הספקטרום של CYT. ג </em> כמוס בתוך aerogels עם חלקיקי מתכת, בעוד שני סוגי ספקטרום airgel שוני מקשה של CYT. ג בתמיסה שנאגרה (איור 7). איור 8 מראה תגובת ניטור תחמוצת חנקן טיפוסית עבור CYT. ג -SiO 2 aerogels ו aerogels המקביל המכילים גם חלקיקי מתכת בנוסף CYT. ג. ההבדל בין הספיגה ב 414 ננומטר וכי ב 408 ננומטר נתפס להגדיל ולאחר מכן לרדת כאשר הג'לים נחשפים תחמוצת חנקן ואז חנקן בהתאמה ברציפות. אם פחמן דו חמצני סופר קריטי לא ישוחרר בקצב איטי מספיק, את הכדאיות של CYT. ג בתוך aerogels יצרה יהיה בסכנה. זה מתגלה על ידי השוואת ספקטרום UV-גלוי וכתוצאה מכך לאחר טביעת ג'לים על ידי שחרור פחמן דו חמצני ב שונהשיעורים (איור 9). איור 1: מנגנון ייבוש נקודה קריטי מנגנון ייבוש נקודה הקריטי שמוצג מן (א) הקדמי (B) חזרה עם דלת הסירה ומכשירי העברת מוצג לצד האחורי של המכשיר.. איור 2: פלטפורמת קרטון פלטפורמת הקרטון התאספה לקיום airgel בנתיב של הקרן של מכשיר.. איור 3: הגדרת חישת תחמוצת חנקן את הגדרת חישת תחמוצת החנקן מוצגת כולל (א) במנדף הסגור 10% תחמוצת חנקן., גליל חנקן 90%, צינורות, ו- T-שסתום, ו- (ב) קובט עם מחטים מוכנסות. איור 4:.. CYT לדוגמא ג -SiO 2 aerogels Aerogels encapsulating 15 מיקרומטר CYT ג ב 4.4 מ"מ, 40 מ"מ, ו -70 מ"מ חיץ פוספט אשלגן מוצגים בהשוואה אגורה משמאל לימין.. aerogels האלה הם בערך גבוה 0.2-0.5 ס"מ. הודפס מחדש באישור 9. איור 5:. CYT ג -SiO 2 ספקטרוסקופיה airgel ספקטרום גלוי של 15 מיקרומטר ציטוכרום C ב (א) 50 מ"מ סול חיץ פוספט.ution; (ב) Au (5 ננומטר) ~ CYT ג -SiO 2 airgel.; (ג) CYT ג -SiO 2 airgel (חשוף לאוויר).; (ד) CYT. ג -SiO 2 airgel (חשופים תחמוצת החנקן עבור 3.5 דקות). ספקטרה נציג אלה של כל סוג של ג'ל מקוזזת לבהירות, ואת הקו המקווקו מציין את המיקום של שיא Soret של CYT. ג במאגר. בעוד כל הספקטרום הוא של 15 מיקרומטר CYT. ג, עובי ג'ל (או גבהים) הם רק 0.2-0.5 ס"מ לעומת cuvet פתרון 1 ס"מ וכתוצאה מכך ספיגת פתרון גבוה. הודפס מחדש באישור 9. איור 6: ספקטרוסקופיה אירוג'ל כמו ריכוז חיץ כמוס מגוונת ממוצעים UV- גלוי ספיגת ספקטרלי של aerogels חלקי אורך הנתיב ג'ל ג'ל encapsulating 15 _.6; M CYT ג ב 70 מ"מ (שחור) (ממוצע של 4 ספקטרום), 40 מ"מ (אדום, מנוקד) (ממוצע של 8 ספקטרום), ו -4.4 מ"מ (ירוק, מקווקו) (ממוצע של ספקטרה 9) חיץ פוספט אשלגן. . הודפס מחדש באישור 9. איור 7:… ספקטרוסקופיה dichroism מעגלית אירוג'ל ספקטרה dichroism מעגלית של CYT ג בתמיסה שנאגרו פוספט נתרן (מוצק), שני ספקטרום נציג CYT ג -SiO 2 aerogels (מקווקו), ושני ספקטרום נציג Au (5 ננומטר) ~ CYT. ג SiO- 2 aerogels (מנוקד). הודפס מחדש באישור 9. איור 8: זיהוי תחמוצת החנקן עם CYT ג -SiO 2. </. sub> aerogels ניטור המשמרת (ΔA = A ננומטר 414 – A ננומטר 408). בעוצמת Soret של CYT ג (אדום מוצק) Au ~ CYT ג (מקווקו כחול) הגלום SiO 2 nanoarchitectures מרוכבים airgel כמו זרימת הגז. הוא toggled בין חנקן (בהתאם המרבי שיא Soret הוא ב ~ 408 ננומטר) ותחמוצת החנקן (בהתאם Soret מקסימלית השיא הוא ב ~ 414 ננומטר). עקום כל הוא ממוצע של 3-4 ניסויים, עם שתיים CYT ג -SiO 2 ניסויים תחת השגחה לאורך ΔA = A ננומטר 414 -. 407 ננומטר מאז למקסימום שיא Soret הראשוני היה ב 407 ננומטר לניסויים אלה. הודפס מחדש באישור 9. איור 9:. השפעת הזמן לשחרר לנוזל סופר ספיגת ספקטרלי UV- גלוי ממוצעים חלקי אורך ג'ל נתיב CYT ג -SiO 2 aerogels enca.psulating 10 מיקרומטר CYT. ג ב 50 מ"מ חיץ פוספט שבו aerogels היבש supercritically נעשה על ידי או פחמן דו חמצני סופר קריטי שחרור מעל 45 דקות (מוצק, שחור (ממוצעת של 9 ספקטרה)) או 7 דקות (מקווקו, אדום (ממוצע של 4 ספקטרום)). הודפס מחדש באישור 9.

Discussion

כפי שתואר, הליך זה פיק CYT קיימא בעקביות. ג כמוסה בתוך aerogels. ריכוז CYT. ג בתוך aerogels יכול להיות מגוון מ 5 עד 15 מיקרומטר ואת ריכוז החיץ של הפתרון ג הראשוני CYT. הכמוס בתוך aerogels יכול להיות מגוון מ 4.4 כדי 70 פוספט מ"מ ללא השפעות מזיקות חמורות על כדאיות חלבון. עם זאת, במרכז שיא רוחב השיא של CYT מאפיין. ג Soret שיא aerogels הקרובים מה הם עבור CYT. ג בתמיסה כאשר CYT. ג מגולם aerogels מפתרונות של 40 מ"מ חיץ 9.

הסינתזה של CYT. ג -SiO 2 aerogels מושפע לגיל חלק ריאגנטים החל. מתנול, tetramethoxysilane, ופתרון אמוניום הידרוקסיד כולם היגרוסקופי ויש להחליפו כל חודשים אחד-על-שתיים. המים עלו שמצטבריםריאגנטים אלה לאורך הזמן משפיעים על מאפיינים מבניים ג'ל ומעבר סול ל-ג'ל זמן.

בעת ביצוע ייבוש סופר קריטי, הסירה העברה של מנגנון ייבוש נקודה קריטית יכול להכיל עד שמונה עשרה 0.5 ס"מ עובי, 1 ג'לים ס"מ קוטר. כפי שתוארו בסעיף הפרוטוקול, מילוי ספציפי הליך ניקוז צריך להיות מלווה להעביר פחמן דו חמצני לתוך-ג'לי סול. חשוב לציין כי בתחילת פרוטוקול הניקוז, תערובת הניקוז של פחמן דו חמצני אצטון זורמת בקצב כה גבוה כי החדרת צינורית הניקוז קופאת נוקשה עם לחות עיבוי לקרח בצד החיצוני. התערובת מתנקזת מכילה קצת מים מאז אצטון אינו נטול מים ומים זה עלולים לקפוא מדי פעם במידה כי החדרת צינורית הניקוז למעשה סותמת. זה הכרחי כדי לצפות עבור כפכפים כאלה ולהקשיב במשך הפסקת הזרימה. שסתום הניקוז צריך להיות סגור במשך כמה דקות כך הסותם יתמוסס אם קבקב מזוהה. בבמקרה הגרוע ביותר, אם שסתום הניקוז אינו סגור, קבקב יכול לגרום כל כך הרבה לחץ כדי לבנות כי החדרת צינורית הניקוז בכוח קופץ מעל המנגנון. לאחר שחלף הפרק לטמיון הראשון, הרוב של אצטון יהיה כבר שטף מתוך המנגנון, ואת המופע של גושי קרח רטובים יקטן באופן דראמטי. הפריקה בהדרגה תידמה קרח יבש כפרוטוקול הניקוז ממשיך עם כל ראיה שיורית של נוכחות אצטון (כגון ריח) הופך לגילוי עד סוף תהליך הייבוש.

לאחר דו תחמוצת הפחמן במנגנון שהתבצעה מעבר מנוזל לנוזל סופר ותהליך האוורור החל, יש צורך לשחרר את הנוזל בקצב איטי לאורך דקות 45 לפחות כפי שצוין בנוהל 9. שיעור גבוה יותר של שחרור יכול להקטין את הכדאיות של CYT. ג (כפי שמוצג באיור 9) בתוך aerogels ואת aerogels עצמם בפועל עשוי להתפרק כמו הנוזל דואר ממהר לברוח מן ג'לים. באופן כללי, גם כאשר aerogels נותר על כנן לאחר פתיחת דלת המנגנון, חשוב לטפל בם בזהירות ובעדינות כפי שהם פריכים יכולים לשבור בקלות.

הג'לים סיליקה בקרה הם שפכו לצד CYT. ג -SiO 2 ג'לים משמשים לאחר ייבוש סופר קריטי כדי לקבוע אם ההעברה פחמן דו חמצני לתוך ג'ל עבר בהצלחה. לפעמים CYT. ג -SiO 2 ג'לי עשויים להופיע מעונן וזה חשוב כדי לקבוע אם זה נובע העברת ממס שלם או אם זה יכול להיות קשור עם הריכוז של CYT. ג או חיץ כמוס בתוך ג'ל. אם את הג'לים סיליקה ללא CYT. C נראה כי מראה הומוגני, שקוף לאורך כל הדרך, זה יכול להיות כעדות כי העברת ממס התרחשה אפילו לגמרי אם CYT. ג -SiO 2 ג'לים יש כמה עננות אליהם. עננות בתוך ג'ל סיליקהללא CYT. ג לאחר הייבוש מציין שחלק אצטון נשאר בתוך ג'לים במהלך האוורור.

כפי שצוין בסעיף הפרוטוקול, אמצעי בטיחות חשוב צריך להילקח כשעובד עם תחמוצת חנקן (NO). כדי לזהות NO באמצעות aerogels, יש צורך לאטום את קובט היטב על מנת למצות את הגז המוזרם על aerogels לתוך במנדף. לחלופין, ספקטרופוטומטר כולו ניתן להעביר לתוך במנדף יחד עם גליל אין גז כאמצעי זהירות נוסף כדי להגביל את החשיפה ל NO גז. במגע עם אוויר לא יהיה מייד לייצר את תחמוצת חנקן הרעיל ביותר, tetroxide החנקן או שניהם. NO יכול גם להגיב עם מים כדי לייצר אדים חומים מאכל. לכן, חשיפה מתמשכת ל NO עלולה לגרום לרעילויות רקמות ישירות.

בעת שימוש CYT. ג -SiO 2 aerogels כדי לזהות נוכחות של תחמוצת החנקן, הלהקה Soret בתחילה יהיה ב ~ 408 ננומטר יעבורל ~ 414 ננומטר בנוכחות של תחמוצת החנקן. לאחר המעבר חזרה חנקן, להקת Soret צריכה להפוך חזרה להיות מרוכז ב ~ 408 ננומטר. זה יכול להיות גם ניתן להשתמש CYT. ג -SiO 2 aerogels כדי לזהות נוכחות של ליגנדים אחרים כגון פחמן חד חמצני 27.

נהלים שפורסמו שונים כוללים צעד נוסף של שילוב חלקיקי זהב או כסף עם CYT. ג בתמיסה לפני ערבוב עם סול supercritically ייבוש לגבש aerogels 4-8. השוואת ספקטרוסקופיה גלוי-UV של CYT. ג גלום aerogels עם חלקיקי מתכת לזה של CYT. ג גלום aerogels ללא חלקיקי מתכת מראה כי אלה שני סוגים של טכניקות אנקפסולציה לייצר CYT. ג כדאיות דומה בתוך aerogels (איור 5) . עם זאת, CYT. ג במארז עם חלקיקי מתכת הוא מעט יותר יציב מאשר CYT. C לתמצתד ללא חלקיקי מתכת בתוך aerogels 9. ספקטרום CD של שני סוגי CYT. Aerogels c הם גם דומים, אם כי הן שונות מן הספקטרום של CYT. ג במאגר המציין כמה התגלגלות של CYT. ג בתוך aerogels (איור 7). דיווחים קודמים על CYT. ג הגלום aerogels מראים כי ספקטרוסקופיה dichroism החוזר סביר ביותר בהערכת השכבה החיצונית ביותר של חלבון, פרש במגע עם ג'ל סיליקה, בתוך CYT רב שכבתי-גרעיני nanoparticle מתכת או. מבנים ג או מבנים מאורגנת פחות או יותר יוצרים כשאף חלקיקי מתכת נמצאים aerogels 4,9. רוב CYT. ג בתוך סוג אחד של מבנה עצמית מאורגן בתוך aerogels נשאר מקופל כפי שהיא נמדדת על ידי ספקטרוסקופית UV- גלוי אף. היתרון של הפרוטוקול המתואר במסמך זה חלקיקי sans הוא שרכישה יקרה או סינתזה גוזל זמן של מתכתהחלקיקים אינם הכרחיים. חלבונים לא לעתים קרובות כבר כמוס בהצלחה בתוך aerogels, ולכן הליך זה חשוב כי זה יכול להוביל להתפתחות של שיטה כללית יותר עבור encapsulating חלבונים אחרים aerogels עם משמעות פוטנציאל התקנים bioanalytical בעתיד.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תמיכה עבור עבודה זו ו / או פרסום סופק על ידי מכון המדע של המכללה של Fairfield באוניברסיטה לאמנויות ומדעים, מענק מחקר בפקולטה Fairfield האוניברסיטה, פרס מדעי מכללת קוטרל מחברת מחקר לקידום המדע, מכללת אוניברסיטת פיירפילד לאמנויות ומדעים ו Fairfield של מהמחלקה לכימיה & ביוכימיה באוניברסיטת. אנו בתודה להכיר ז'אן מארי וואלאס עבור מועיל הרבה תובנות ועצות לגבי תחום מחקר הכללי הזה. בנוסף, אנו מרחיבים מאוד תודה מיוחדת לכל עבר, הנוכחי, וחוקרים ראשון העתיד של מעבדת המחקר הארפר-Leatherman.

Materials

Potassium phosphate, monobasic Fisher Scientific P285-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific P288-500 Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water Millipore Direct-Q 18 MΩ cm
pH meter and electrode Denver Instrument UB-10
Cytochrome c from equine heart Sigma Aldrich C7752-100MG  ≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C
Glass scintillation vials Wheaton 03-341-25J 20 mL, O.D. x height (with cap):  28 mm x 61 mm
Disposable cuvette Fisher Scientific 14-955-126 methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter) JASCO J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers Fisher Scientific 01-291-10 50 mL
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS) Sigma Aldrich 218472-500G 98% purity
Methanol Fisher Scientific A457-4 GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution Sigma Aldrich 221228-25ML-A ACS reagent, 28.0-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials Sigma Aldrich Z376825-1PAK 16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap various
Parafilm M laboratory wrapping film Fisher Scientific S37440
Plastic syringe plunger various use syringe plunger from 3 mL syringe
Ethyl alcohol Acros 61509-0040 Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone Fisher Scientific A949-4 HPLC grade
Critical point drying apparatus Quorum Technologies E3000 Series
Circulator Fisher Scientific Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder Tech Air siphon tube
Micrometer Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder Tech Air Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder Airgas
Tygon tubing various
T-switch valve various
syringe needles various
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettigrew, G. W., Moore, G. R. . Cytochromes c. Biological Aspects. , (1987).
  2. Moore, G. R., Pettigrew, G. W. . Cytochromes c. Evolutionary, Structural, and Physicochemical Aspects. , (1990).
  3. Scott, R. A., Mauk, A. G. . Cytochrome c: A Multidisciplinary Approach. , (1996).
  4. Wallace, J. M., Rice, J. K., Pietron, J. J., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silica nanoarchitectures incorporating self-organized protein superstructures with gas-phase bioactivity. Nano Lett. 3 (10), 1463-1467 (2003).
  5. Wallace, J. M., Dening, B. M., Eden, K. B., Stroud, R. M., Long, J. W., Rolison, D. R. Silver-colloid-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. Langmuir. 20 (21), 9276-9281 (2004).
  6. Wallace, J. M., Stroud, R. M., Pietron, J. J., Long, J. W., Rolison, D. R. The effect of particle size and protein content on nanoparticle-gold-nucleated cytochrome c. superstructures encapsulated in silica nanoarchitectures. J.Non-Cryst. Solids. 350, 31-38 (2004).
  7. Rolison, D. R., Wallace, J. M., Pietron, J. J., Rice, J. K., Stroud, R. M. U. S. . US Patent. , (2007).
  8. Harper-Leatherman, A. S., Wallace, J. M., Rolison, D. R., Minteer, S. D. Cytochrome c. stabilization and immobilization in aerogels. Enzyme Stabilization and Immobilization: Methods and Protocols. 679, 193-205 (2011).
  9. Harper-Leatherman, A. S., et al. Simplified procedure for encapsulating cytochrome c. in silica aerogel nanoarchitectures while retaining gas-phase bioactivity. Langmuir. 28 (41), 14756-14765 (2012).
  10. Hitihami-Mudiyanselage, A., Senevirathne, K., Brock, S. L. Assembly of phosphide nanocrystals into porous networks: Formation of InP gels and aerogels. ACS Nano. 7 (2), 1163-1170 (2013).
  11. Fricke, J. . Aerogels. , (1986).
  12. Hüsing, N., Schubert, U. Aerogels-airy materials: chemistry, structure, and properties. Angew. Chem. Int. Edit. 37 (1-2), 22-45 (1998).
  13. Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. . Aerogels Handbook. , (2011).
  14. Kazuyoshi, K. Recent progress in aerogel science and technology. Adv. Porous Mater. 1 (2), 147-163 (2013).
  15. Leventis, N., Elder, I. A., Anderson, M. L., Rolison, D. R., Merzbacher, C. I. Durable modification of silica aerogel monoliths with fluorescent 2,7-diazapyrenium moieties. Sensing oxygen near the speed of open-air diffusion. Chem. Mater. 11 (10), 2837-2845 (1999).
  16. Plata, D. L., et al. Aerogel-platform optical sensors for oxygen gas. J. Non-Cryst. Solids. 350, 326-335 (2004).
  17. Rolison, D. R., Pietron, J. J., Long, J. W. Controlling the sensitivity, specificity, and time signature of sensors through architectural design on the nanoscale. ECS Trans. 19 (6), 171-179 (2009).
  18. Carroll, M. K., Anderson, A. M., Aegerter, A. M., Leventis, N., Koebel, M. M. Aerogels as platforms for chemical sensors. Aerogels Handbook. , 637-650 (2011).
  19. Rolison, D. R. Catalytic nanoarchitectures-The importance of nothing and the unimportance of periodicity. Science. 299 (5613), 1698-1701 (2003).
  20. Pietron, J. J., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Using three dimensions in catalytic mesoporous nanoarchitectures. Nano Lett. 2 (5), 545-549 (2002).
  21. Anderson, M. L., Morris, C. A., Stroud, R. M., Merzbacher, C. I., Rolison, D. R. Colloidal gold aerogels: Preparation, properties, and characterization. Langmuir. 15 (3), 674-681 (1999).
  22. Anderson, M. L., Stroud, R. M., Rolison, D. R. Enhancing the activity of fuel-cell reactions by designing three-dimensional nanostructured architectures: Catalyst-modified carbon-silica composite aerogels. Nano Lett. 3 (9), 1321 (2003).
  23. Chervin, C. N., et al. Defective by design: vanadium-substituted iron oxide nanoarchitectures as cation-insertion hosts for electrochemical charge storage. J. Mater. Chem. A. 3 (22), 12059-12068 (2015).
  24. Ellerby, L. M., et al. Encapsulation of proteins in transparent porous silicate-glasses prepared by the sol-gel method. Science. 255 (5048), 1113-1115 (1992).
  25. Massari, A. M., Finkelstein, I. J., Fayer, M. D. Dynamics of proteins encapsulated in silica sol-gel glasses studied with IR vibrational echo spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 128 (12), 3990-3997 (2006).
  26. Ray, A., Feng, M., Tachikawa, H. Direct electrochemistry and Raman spectroscopy of sol-gel-encapsulated myoglobin. Langmuir. 21 (16), 7456-7460 (2005).
  27. Blyth, D. J., Aylott, J. W., Richardson, D. J., Russell, D. A. Sol-gel encapsulation of metalloproteins for the development of optical biosensors for nitrogen-monoxide and carbon-monoxide. Analyst. 120 (11), 2725-2730 (1995).
  28. Lan, E. H., Dave, B. C., Fukuto, J. M., Dunn, B., Zink, J. I., Valentine, J. S. Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem. 9 (1), 45-53 (1999).
  29. Miller, J. M., Dunn, B., Valentine, J. S., Zink, J. I. Synthesis conditions for encapsulating cytochrome c. and catalase in SiO2 sol-gel materials. J. Non-Cryst. Solids. 202 (3), 279-289 (1996).
  30. Ronda, L., Bruno, S., Faggiano, S., Bettati, S., Mozzarelli, A., Poole, R. K. Oxygen binding to heme proteins in solution, encapsulated in silica gels, and in the crystalline state. Methods in Enzymology. 437, 311-328 (2008).
  31. Margoliash, E., Frohwirt, N. Spectrum of Horse-Heart Cytochrome c. Biochem. J. 71 (3), 570-572 (1959).

Tags

Cytochrome CSilica AerogelBiosensorBioactivityGas-phase ReactionEncapsulationSol-gelPorous MatrixProtein EncapsulationAnalytical DeviceTetraethoxysilaneMethanolWaterAmmonium HydroxidePolypropylene Vials

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harper-Leatherman, A. S., Pacer, E. R., Kosciuszek, N. D. Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity. J. Vis. Exp. (109), e53802, doi:10.3791/53802 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image