والطريقة المبسطة للفائقة منخفضة الكثافة، طويل الأجل الابتدائية الحصين العصبية الثقافة
Summary
Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.
Abstract
زراعة الخلايا العصبية الحصين الابتدائية في المختبر يسهل الاستجواب الآلية من العديد من جوانب التنمية العصبية. يمكن فصلها الخلايا العصبية قرن آمون الجنينية غالبا ما تنمو بنجاح على coverslips الزجاج في كثافة عالية في ظروف خالية من المصل، ولكن الثقافات منخفض الكثافة عادة ما تتطلب إمدادات من العوامل الغذائية التي شارك في زراعة لهم طبقة الدبقية المغذية، وإعداد والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وشاقة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود الدبقية قد يربك تفسير النتائج والدراسات يستبعد على آليات الخلايا العصبية المحددة. هنا، يتم تقديم طريقة مبسطة لكثافة منخفضة للغاية (~ 2000 الخلايا العصبية / سم 2)، على المدى الطويل (> 3 أشهر) ثقافة العصبية الحصين الأولية التي هي تحت ظروف خالية في الدم وبدون دعم الخلايا الدبقية. تزرع الخلايا العصبية منخفضة الكثافة على بولي-D-يسين coverslips المغلفة، وانقلبت على الخلايا العصبية كثافة عالية تزرع في 24 لوحة جيدا. بدلا من استخدام النقاط البارافين لخلق مساحة بين هذا وذاكن طبقتين العصبية، المجربون يمكن ببساطة أحفر والبلاستيك أسفل البئر، التي الخلايا العصبية عالية الكثافة الموجودة، لخلق microspace تساعد على نمو الخلايا العصبية منخفض الكثافة. وشارك في ثقافة لا يمكن الحفاظ عليه بسهولة ل> 3 أشهر من دون خسارة كبيرة من الخلايا العصبية منخفض الكثافة، وبالتالي تسهيل الدراسة المورفولوجية والفسيولوجية من هذه الخلايا العصبية. لتوضيح هذا الشرط ثقافة ناجحة، يتم توفير البيانات لإظهار تشكيل المشبك وافر في الخلايا كثافة منخفضة بعد ثقافة لفترات طويلة. يسهل هذا النظام شارك في الثقافة أيضا بقاء الخلايا العصبية الفردية المتناثرة التي تزرع في جزر ركائز بولي-D-ليسين وبالتالي تشكيل اتصالات autaptic.
Introduction
تزايد الخلايا العصبية الحصين تحت ظروف في المختبر تمكن الملاحظة والتلاعب التجريبية من هذه الخلايا العصبية التي هي على خلاف ذلك غير ممكن في الجسم الحي. ويستخدم هذا المنهج التجريبي على نطاق واسع للكشف عن الآليات العصبية للنمو، والاستقطاب، والمواصفات محوار والاتجار وتوطين التحت خلوية من البروتينات، تشكيل المشبك والنضج الوظيفي 1. هذه في المختبر الخلايا العصبية الحصين مثقف، عندما تحصد من المراحل الجنينية في وقت متأخر، ونقي نسبيا (> 90٪) خلايا glutamatergic مورفولوجيا هرمي 2. لأن كانت تزرع الخلايا العصبية في سطح 2-D في ظل ظروف المختبر، يسمح هذا الأسلوب المراقبة سهلة، مثل التصوير الحي أو مناعية (ICC) تلطيخ خلال البؤري واحدة 3؛ أو التلاعب، مثل العلاج من تعاطي المخدرات وتعداء 3-6. عندما نمت في كثافة عالية، تميل الخلايا العصبية لديهم معدلات عالية من البقاء على قيد الحياة بسبب ارتفاع المشتركncentrations من عوامل النمو يفرز بالإضافة إلى دعم الهضمية من وسائط النمو، وأيضا بسبب الآليات التي تعتمد على الاتصال محوار 7. ومع ذلك، وانخفاض كثافة الخلايا العصبية قرن آمون مرغوبة للدراسات المورفولوجية، حيث الخلايا العصبية الفردية يمكن تصويرها في مجملها أو الملون للتحليل للمحكمة الجنائية الدولية. الخلايا العصبية منخفض الكثافة من الصعب الحفاظ في الثقافة نظرا لعدم وجود دعم نظير الصماوي وبالتالي غالبا ما تتطلب الدعم الغذائي من الدبقية (عادة القشرية نجمية) طبقة المغذية، التي يجب أن تكون مستعدة قبل ثقافة العصبية 2. عندما شارك في تربيتها مع طبقة تغذية الخلايا الدبقية، وتزرع الخلايا العصبية منخفض الكثافة coverslips على، ثم انقلبت على أعلى طبقة الدبقية بحيث الخلايا العصبية كثافة منخفضة والدبقية في مواجهة بعضهما البعض. يتم إنشاء مكان ضيق صغير بين الدبقية والخلايا العصبية عن طريق وضع النقاط شمع البارافين على زوايا لل coverslips، وبالتالي خلق "ساندويتش" تخطيط 2،8،9. سوف تنمو الخلايا العصبية منخفض الكثافة ثithin مكان ضيق بين الدبقية وساترة، مما يخلق المكروية متساهلة مع العوامل المركزة التي يفرزها الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. هذا النهج غلة منخفض الكثافة، الخلايا العصبية كاملة النمو التي يتم بصرف النظر متباعدة إلى حد معقول، وبالتالي تسهيل وضع العلامات للمحكمة الجنائية الدولية أو الدراسات التصويرية الحية.
لكن هناك عائقا واضحا من الخلايا العصبية الدبقية الثقافة المشتركة، بصرف النظر عن كونها تستغرق وقتا طويلا وشاقة، هو أنه يمنع دراسة الخلايا العصبية محددة، أو خلية مستقلة، وآليات. على الرغم من أن هذا النظام هو أقل تعقيدا بكثير مما كانت عليه في الجسم الحي الأنسجة العصبية، والأثر الدبقية على تطوير الخلايا العصبية من خلال عوامل محددة لا ولكن في ذات بالكامل يفرز يمكن أن يتغلب على تجارب 10. لذلك، في التجارب التي تتطلب التحقيق في آليات محددة الخلايا العصبية، وظروف ثقافة المعرفة التي تعمل على إزالة الدم وطبقة دعم الدبقية ضرورية. نجحت وكانت دراسة سابقة في زراعة تركيزات منخفضة من الخلايا العصبية (~ 9000 خلية / سم 2) باستخدام الالعناصر الأرضية النادرة الأبعاد مصفوفة هيدروجيل 11. منذ السكان العصبية نقي نسبيا يمكن تربيتها في كثافة عالية في ظل ظروف خالية المصل دون دعم الدبقية، ونحن نفترض أن كثافة منخفضة للغاية من الخلايا العصبية قرن آمون يمكن زراعتها في المصل محددة مجانا مستنبت من شارك في زرع لهم الخلايا العصبية عالية الكثافة، في بطريقة مشابهة لالخلايا العصبية الدبقية الثقافة المشتركة اعتمدت تقليديا. في الواقع، استخدمت عالية الكثافة الثقافات الخلايا العصبية قرن آمون في تكوين "ساندويتش" مؤخرا لدعم عدد صغير من الخلايا العصبية والغدد الصماء كبير الخلايا المتخصصة 12.
لذلك، وشارك في الثقافة مع الخلايا العصبية عالية الكثافة قد تسمح الخلايا العصبية منخفض الكثافة لتلقي عوامل غذائي الدعم غير كافية لتمكين البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. وهكذا وضعت هذا البروتوكول من الخلايا العصبية فائقة الكثافة المنخفضة والتحقق من صحتها. ويمكن تنفيذ البروتوكول، خلال تجربة واحدة واحدة، من خلال إعداد كثافة عالية (~ 250000 خلية / مل) ديسالخلايا العصبية قرن آمون sociated أولا، ثم جعل التخفيف أن تسفر عن كثافة ~ 10،000 الخلايا العصبية / مل (~ 3000 الخلايا العصبية / ساترة، أو ~ 2000 الخلايا العصبية / سم 2)، وهو أقل بكثير من معظم التقارير الثقافات منخفض الكثافة 2،3،9 ، 11،13. ويشار إلى هذه الحالة ثقافة فضفاضة باسم الثقافة "فائقة الكثافة المنخفضة" وتستخدم مع "منخفض الكثافة" بين changeably. ومطلي الخلايا العصبية عالية الكثافة على بولي-D-يسين المغلفة 24 لوحات جيدا. في حين أن المصنف الخلايا العصبية منخفضة الكثافة على بولي-D-يسين المغلفة coverslips الزجاج 12 ملم التي يتم وضعها داخل 24 لوحة جيدا آخر. وانقلبت لل coverslips مع الالتزام الخلايا العصبية منخفضة الكثافة على أعلى من الخلايا العصبية عالية الكثافة في وقت لاحق 2 ساعة بعد ينحدرون من الخلايا العصبية وتعلق لل coverslips. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من استخدام النقاط شمع البارافين لرفع لل coverslips فوق طبقة الخلايا العصبية عالية الكثافة، وقد استخدم حقنة إبرة 18 G لحفر الجزء السفلي من 24 لوحات جيدة مع اثنين من خطوط متوازية. وdispl الناتجةACED والبلاستيك المجاورة توفر الدعم المرتفع للcoverslips الزجاج. يتم قياس هذه المساحة باستمرار على 150-200 ميكرون، والذي يسمح كافية من الأوكسجين والمتوسطة التبادل الثقافي مع توفير المكروية مع العوامل الغذائية المركزة. تحت هذا الشرط، والخلايا العصبية منخفض الكثافة تنمو على نطاق واسع، ويمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من ثلاثة أشهر في الثقافة. عندما و transfected هذه الخلايا العصبية مع البلازميد GFP بعد ثلاثة أسابيع في الثقافة، ورصع التشعبات بغزارة مع العمود الفقري شجيري. كدليل على المبدأ، وتعرض البيانات التي تبين أن هذا النظام المشترك الثقافة يدعم منخفضة للغاية الثقافات كثافة الخلايا العصبية قرن آمون المصنف على بولي-D-ليسين "، الجزر الصغيرة، حيث تشكل الخلايا العصبية اتصالات autaptic التي قد تسهل التحقيق في خلية ، آليات شبكة مستقلة -autonomous.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكول مفصل للثقافة على المدى الطويل منخفضة للغاية كثافة الخلايا العصبية glutamatergic الحصين تحت ظروف خالية المصل. في ~ 2000 الخلايا العصبية / سم 2، وكثافة أقل اثنين على الأقل أضعاف من معظم "منخفض الكثافة استعدادات الثقافة مع أو بدون دعم الدبقية التي أبلغ عنها…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).
Materials
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | Protect from light |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | aliquot, store in 0.6ml size |
| GlutaMAX-I | Life Technologies | 35050-061 | dilute 100X |
| antibiotic-antimycotic (AA) | Life Technologies | 15240-096 | dilute 100X |
| Complete Culture medium | Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I | ||
| Wash medium | same as 'Neurobasal medium' | ||
| Feed medium | Neurobasal with 1X B27 supplement | ||
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | prepare 100X stock at 0.6mg/ml |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | M.W. 70000-150000 |
| borate buffer | Sigma-Aldrich | B6768 (boric acid); 71997(borax) | 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl |
| 12-mm round glass coverslips | Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/12 | No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply |
| proFection transfection kit | Promega | E1200 | see protocol for details |
| 2X HEPES buffered saline (HBS) | Promega | E1200 | see protocol for details |
| Syringe filter | Pall Corporation | 4192 | 0.2um pore size |
| Endofree plasmid prep kit | Qiagen | 12362 | for preparation of transfection grade plasmid DNA |
| anti-MAP2 antibody | Millipore | MAB3418 | mouse antibody, clone AP20 |
| anti-p-Tau antibody | Millipore | AB10417 | rabbit polyclonal antibody |
| anti-NR1 antibody | Millipore | MAB1586 | mouse antibody, clone R1JHL |
| anti-GluR1 antibody | Millipore | AB1504 | rabbit polyclonal antibody |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher | 14025092 | 500ml size |
References
- Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
- Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
- Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
- Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
- Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
- Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
- Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
- Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
- Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).
