Transcriptome Profiling של<em> In-Vivo</em> עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
אובדן עוברי מוקדם בפרות חולבות גבוהות בהפקה הוא אחד האתגרים המרכזיים בתעשיית חלב 1, 2. שור הפך מודל מעניין ללמוד פיתוח עובר preimplantation אדם בשל תהליך התפתחותי הדומה שלהם 3, 4. עם זאת, מחקרים נוספים נדרשים להיות בעלי הבנה טובה יותר על גנים המעורבים בהתפתחות העוברית המוקדמת שור.
אחרי עשרים שנה מאז טכנולוגית microarray הראשונה שפותחה בשנת 1995 5, התפתחות שגיאות דפוס מופחת טכנולוגיית ייצור בדיקה מתוחכמות יותר ושונה של שבבי מערך בתוך ובין פלטפורמות microarray השונות 6. טכנולוגית microarray משופרת הביאה יישום נרחב של טכנולוגיה זו במחקר קליני 7 ולאחרונה, ב q עובר המוקדםuality הערכה 8.
הכמות הגדולה של חומר הנדרש עבור טכנולוגית microarray היא הסיבה העיקרית מדוע טכנולוגית microarray בתחילה נכשלה להזין מספר של תחומי מחקר כגון התפתחות עוברית מוקדמת. לאחרונה, שיטות הגברה RNA שופרו כדי להגביר באופן ליניארי RNA עד רמת מיקרוגרם מ-ננוגרם תת החל RNA חומר 9. ישנן מספר הגברת RNA המסחרית ערכות קיימות בשוק; עם זאת, הערכות המפותחות יותר הפופולריות קשורות Ribo-יחיד פריימר איזו תרמים הגברת 10 ו אמרגן T7 מונע 11 שיטות. הגברת RNA antisense הפופולרית ביותר משתמשת ב שעתוק במבחנה עם פריימר אוליגו dT קשר אמרגן T7 ב 5 'סוף 12. טכנולוגיה זו מאפשרת שמירה על רוב תמלילי אנטי תחושה נציג לאחר f הגברה ליניאריתאו מערכי הכלאה 13. שיטה זו הותאמה כדי להגביר רמת picogram של רנ"א הכל מופק שור עובר 8.
הצמדת יוניברסל מערכת (ULS) היא שיטת התיוג אשר ישירות משלבת את ה- DNA או RNA מוגבר עם צבע פלואורסצנטי צמוד פלטינה או Cyanine 547 או Cyanine 647, על ידי יצירת קשר קואורדינטיבית על מצבת N7 של גואנין 14. שיטה זו הותאמה במחקר עובר כדי ליצור יותר יציב מוגבר ארנה ללא שינוי לעומת aminoallyl שהשתנה ארנה שנוצרה על ידי שיטה אנזימטית 15. שני שיטות לצבוע וסימון שני צבעים יחידים הותאמו באמצעות מערכת הצמדת יוניברסל microarray. מחקר השוואות microarray גדול היה כי קיימת קורלציה טובה של איכות נתונים בין פלטפורמות מערך אחד ושני צבע 6.
לאחרונה, הוא כונן אמרגן T7n antisense RNA הגברה וסימון ULS שיטות פותחו כדי לספק פרוטוקול אמין יותר כדי לייצר כמות מספקת של איכות גבוהה שכותרתו חומרי ארנה כלת microarray 8, 16. לכן, מחקר זה מספק פרוטוקול להפגין חלק מן הצעדים החשובים של מיצוי RNA לניתוח נתונים מעורבים microarray שני צבעים באמצעות עוברי שור יום 7 כדוגמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבעיה הראשונה לבצע ניתוח microarray באמצעות עוברי שור יום 7 אינו מקבל כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה ללימוד ביטוי גנים. מיצוי RNA פנול / כלורופורם מסורתי שיטת משקעי אתנול אינו מומלץ יום 7 עובר, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה פנול שאריות האפשרית עיכוב תגובת הגברת RNA. במקום זאת, שיטה סטנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
References
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006).
- Wrenzycki, C., et al. Effects of culture system and protein supplementation on mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum. Reprod. 16 (5), 893-901 (2001).
- Menezo, Y. J., Herubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reprod. Biomed. Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
- Rhodes, D. R., Chinnaiyan, A. M. Integrative analysis of the cancer transcriptome. Nat. Genetics. 37, 31-37 (2005).
- Robert, C., et al. Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78 (9), 651-664 (2011).
- Nygaard, V., Hovig, E. Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling. Nucleic Acids Res. 34 (3), 996-1014 (2006).
- Kurn, N., Chen, P., Heath, J. D., Kopf-Sill, A., Stephens, K. M., Wang, S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 51 (10), 1973-1981 (2005).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (5), 1663-1667 (1990).
- Phillips, J., Eberwine, J. H. Antisense RNA Amplification: A linear amplification method for analyzing the mRNA population from single living cells. Methods. 10 (3), 283-288 (1996).
- Gilbert, I., Scantland, S., Dufort, I., Gordynska, O., Labbe, A., Sirard, M. A., Robert, C. Real-time monitoring of aRNA production during T7 amplification to prevent the loss of sample representation during microarray hybridization sample preparation. Nucleic Acids Res. 37 (8), 65 (2009).
- Gijlswijk, R. P., Talman, E. G., Jansse, P. J., Snoeijers, S. S., Killian, J., Tanke, H. J., Heetebrij, R. J. Universal Linkage System: versatile nucleic acid labeling technique. Expert Re. Mol. Diagn. 1 (1), 81-91 (2001).
- Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E. L., Dufort, I., Sirard, M. A., Robert, C. Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16 (8), 601-616 (2010).
- Tsoi, S., et al. Development of a porcine (Sus scofa) embryo-specific microarray: array annotation and validation. BMC Genomics. 13, 370 (2012).
- Salehi, R., et al. Superovulatory response and embryo production in Holstein cows fed diets enriched in oleic, linoleic or α-linolenic acid. Reprod. Fertil. Dev. 26 (1), 218-218 (2013).
- Thangavelu, G., Colazo, M. G., Ambrose, D. J., Oba, M., Okine, E. K., Dyck, M. K. Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic development in lactating Holstein cows. Theriogenology. 68 (7), 949-957 (2007).
- . Agilent 2100 Bioanalyzer User’s Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack) (2016)
- Kerr, K. F. Extended analysis of benchmark datasets for Agilent two-color microarray. BMC Bioinformatics. 8, 371 (2007).
- Zhu, Q., Miecznikowski, J. C., Halfon, M. S. A wholly defined Agilent microarray spike-in dataset. Bioinformatics. 27 (9), 1284-1289 (2011).
- Vallee, M., Gravel, C., Palin, M. F., Reghenas, H., Stothard, P., Wishart, D. S., Sirard, M. A. Identification of novel and known oocyte-specific genes using complementary DNA subtraction and microarray analysis in three different species. Biol. Reprod. 73 (1), 63-71 (2005).
- Thomas, P. D., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Mi, H., et al. The PANTHER database of protein families, subfamilies, functions and pathways. Nucleic Acids Res. 33, 284-288 (2005).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nat. Protoc. 8, 1551-1566 (2013).
- Ross, P. J., Wang, K., Kocabas, A., Cibelli, J. B. Housekeeping gene transcript abundance in bovine fertilized and cloned embryos. Cell Reprogram. 12 (6), 709-717 (2010).
- Gilbert, I., et al. The dynamics of gene products fluctuation during bovine pre-hatching development. Mol. Reprod. Dev. 76, 762-772 (2009).
- Vallee, M., et al. Revealing the bovine embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138 (1), 95-105 (2009).
- Dafforn, A., et al. Linear mRNA amplification from as little as 5 ng total RNA for global gene expression analysis. Biotechniques. 37 (5), 854-857 (2004).
- Beaujean, N., Jammes, H., Jouneau, A., Dufort, I., Rovert, C., Sirard, M. A. Nuclear Reprogramming. Studying Bovine Early Embryo Transcriptome by Microarray. , (2015).
- Patterson, T. A., et al. Performance comparison of one-color and two-color platforms within the MicroArray Quality Control (MAQC) project. Nat. Biotechnol. 24 (9), 1140-1150 (2006).
