Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Le but de l'expérience est à l'image et de caractériser le flux moléculaire de filamentous- (F-) actine dans les cellules vivantes T, au-delà de la limite de diffraction afin d'établir le sens d'écoulement et de l'ampleur au cours synapse immunologique (IS) de la formation. Cette technique sera réalisée à l'aide d'un microscope à éclairage structurée (SIM) en mode fluorescence totale de réflexion interne (TIRF), l'imagerie de cellules T Jurkat qui font synapse artificielle sur l'activation des lamelles revêtues d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3. Les formes se situe entre un lymphocyte T et sa cible; une cellule présentatrice d'antigène (APC) à l'récepteur des cellules T (TCR) ^1,2 d'activation. Comme cela est la première étape pour déterminer si le système immunitaire adaptatif génère une réponse immunitaire à une infection, les conséquences de la réactivité aux stimuli incorrecte peut provoquer un certain nombre de maladies. L'importance de l'interaction des cellules T-APC est bien documentée, cependant, le rôle (s) de l'adulte est après si TCR initialeinternalisation gnal sont pas encore pleinement compris.

Comme le cytosquelette est pensé pour aider deux processus liés à l'activation du TCR (le mouvement des molécules à la membrane plasmique et le contrôle des molécules dépendant du cytosquelette d'actine ^3,4 signalisation), de comprendre comment le cytosquelette réorganise spatialement et temporellement feront bien comprendre les étapes de la réorganisation moléculaire pendant la formation de la synapse. Le flux rétrograde de F-actine est pensé pour corral grappes TCR vers le centre de la synapse immunologique, cette translocation est considéré comme vital pour la cessation du signal et le recyclage; aidant l'équilibre délicat de l'activation des cellules T ^5.

Bien que la microscopie à fluorescence standard est un outil flexible qui continue de donner un aperçu sur de nombreux événements biologiques y compris les interactions cellule-cellule, elle est limitée par la capacité du système pour résoudre avec précision de multiples fluorophores résidant plus près que la Diffrlimite d'action (≈200 nm) de l'autre. Comme de nombreux événements moléculaires dans les cellules impliquent des populations denses de molécules et présentent réarrangement dynamique soit en repos ou lors de la stimulation spécifique, la microscopie optique conventionnelle ne fournit pas une image complète.

L'utilisation de l'imagerie super-résolution a permis aux chercheurs de contourner la limite de diffraction en utilisant une variété de techniques. Seule molécule localisation microscopie (SMLM) tels que PALM et STORM ^6,7 a la capacité de résoudre l'emplacement de molécules jusqu'à une précision de l'ordre de 20 nm, cependant, ces techniques reposent sur ​​des temps d'acquisition longues, construire une image sur plusieurs cadres . En général, cela nécessite des échantillons à être fixes ou pour les structures à faible mobilité présentent fluorophores si simples ne sont pas interprété comme de multiples points. Alors que l'épuisement de l'émission stimulée (STED) imagerie permet de super-résolution par le biais très sélectif confocale excitation ^8, le balayage nécessaireapproche peut être lente sur des champs entiers de cellules de vue. STED démontre également phototoxicité important pour des résolutions plus élevées en raison de l'augmentation de la puissance du faisceau d'épuisement.

Structuré microscopie éclairage (SIM ⁹⁾ offre une alternative à ces méthodes, capables de doubler la résolution d'un microscope à fluorescence standard et est plus compatible avec l'imagerie des cellules vivantes que les techniques de SMLM actuelles. Il utilise des puissances inférieures laser, sur un système à grand champ pour les champs de cellules entières de vue; Fournir davantage des vitesses d'acquisition, et est compatible avec l'étiquetage fluorophore standard. La nature à grand champ de la carte SIM permet également l'utilisation de la fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) pour l'excitation hautement sélectif, avec des profondeurs de pénétration dans la dimension axiale de <100 nm.

Spectroscopie de corrélation d'images (ICS) est une méthode de corrélation des fluctuations d'intensité de fluorescence. Une évolution de ICS; Im spatio-temporelleâge spectroscopie de corrélation (STICS ¹⁰⁾ corrèle signaux fluorescents intracellulaires dans le temps et l'espace. En corrélant intensités de pixels entourant les pixels de retard dans des trames par l'intermédiaire d'une fonction de corrélation, l'information est acquise en ce qui concerne les vitesses d'écoulement et de directivité. Pour assurer objets statiques ne pas interférer avec l'analyse STICS, un filtre d'objet immobile est mis en œuvre, qui travaille en soustrayant une moyenne mobile des intensités des pixels.

La technique présentée ici est considérée comme étant la première démonstration de la spectroscopie de corrélation d'image étant appliqué à des données de microscopie super-résolution pour quantifier le flux moléculaire dans ¹¹ des cellules vivantes. Cette méthode améliore l'imagerie par diffraction limitée des flux F-actine via une analyse STICS ¹² et conviendrait chercheurs qui souhaitent déterminer le flux moléculaire en deux dimensions dans les cellules vivantes, à partir de données acquises à des résolutions spatiales au-delà de la limite de diffraction de la lumière.