구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름
Summary
To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.
Abstract
필라멘트는 액틴과 운동성, 면역 세포, 면역 시냅스로 알려진 키 세포 – 세포 상호 작용의 형성을 포함한 세포 과정의 대부분에서 중요한 역할을한다. F 액틴 또한 서브 멤브레인 소포 역학 및 단백질 클러스터링 포함한 세포의 막에 분자량 분포를 조절하는 역할을하는 것으로 추측된다. 표준 광학 현미경 기술은 일반화 된 회절 제한 관찰 할 수 있도록하지만, 클러스터링 및 분자 류를 포함한 많은 세포 및 분자 이벤트는 지금까지 표준 광학 현미경의 분해능 아래 길이 규모의 인구 집단에서 발생합니다. 초 해상도 영상 법 구조화 조명 현미경 전반사 형광을 결합하여, T 세포의 면역 시냅스에서 F 액틴의 이차원 분자 흐름을 기록 하였다. 정량화 resul을 생성 시공간 이미지 상관 분광법 (STICS)을 적용 하였다,속도 히스토그램 및 흐름의 방향성과 크기를 나타내는 벡터지도의 형태로 TS. 이 프로토콜의 세부 서브 회절 레벨에서 유동 경로를 생성하는 초 – 해상도 이미징 STICS 기법의 조합을 설명한다. 이 기술은 시냅스 형성시 T 세포의 외주에 걸쳐 액틴 대칭 역행과 구심력 흐름을 확인하는데 사용 하였다.
Introduction
실험의 목적은 이미지이며 면역 시냅스 (IS)을 형성하는 동안 흐름의 방향 및 크기를 설정하기 위해 회절 한계를 넘어, T 세포를 거주 filamentous- (F-) 액틴의 분자 유동을 특성화. 이 기술은 안티 CD3- 및 항 CD28 항체로 코팅 된 커버 활성화에 인공 시냅스 형성는 Jurkat T 세포를 이미징, 전반사 형광 (TIRF) 모드에서 구조화 된 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 수행 될 것이다. T 세포와 표적 사이의 IS 형태; T 세포 수용체 (TCR) 활성화에 따라 1,2- 항원 제시 세포 (APC). 이 적응성 면역계는 감염에 대한 면역 반응을 생성할지 여부를 결정하는 첫 번째 단계이기 때문에, 자극에 대한 부정확 한 응답의 결과는 질환을 유발할 수있다. APC T 세포 상호 작용의 중요성은 잘 기록되어있다, 그러나, 성숙한의 역할 (들)의 초기 TCR SI 이후gnal 국제화는 아직 완전히 이해되어야한다.
골격은 단계를 해명 할 시간적 TCR 활성화 (세포막에서 분자의 운동과 3,4- 골격 액틴에 의존 신호 분자의 제어), 세포 골격이 공간적으로 재 배열 방식을 이해 연결된 두 프로세스를 원조하고 생각된다로서 시냅스 형성 동안 분자 구조 조정의. F – 굴지의 역행 흐름이 면역 시냅스의 중심을 향해 TCR 클러스터를 가축 위해 생각하고,이 전위는 신호 정지 및 재활용에 매우 중요 할 것으로 생각된다; T 세포 활성화 (5)의 미세한 균형을 은닉.
표준 형광 현미경이 세포 – 세포 상호 작용을 비롯한 다양한 생물학적 이벤트에 대한 통찰력을 제공하고 유연한 도구이지만, 그것은 정확하게 diffr보다 가까운 상주 여러 형광체를 해결하는 시스템의 능력에 의해 제한된다서로의 활동 제한 (≈200 ㎚). 세포 내에서 많은 분자 이벤트 분자의 밀도가 인구를 포함하고 정지 또는 특정 자극에 하나 동적 재 배열을 나타내는 바와 같이, 기존의 광학 현미경은 전체 그림을 제공하지 않습니다.
초 해상도 영상의 사용은 연구자들이 다양한 기술을 이용하여 회절 한계를 회피 할 수있다. 손바닥과 폭풍 6,7가 약 20 nm의 정밀도로 분자의 위치를 해결할 수있는 능력을 가지고 단일 분자 현지화 현미경 (SMLM)와 같은, 그러나, 이러한 기술은 많은 프레임을 통해 이미지를 구축, 긴 획득 시간에 의존 . 일반적으로이 고정되는 샘플을 요구 또는 구조가 낮은 이동성을 전시하기 때문에 하나의 형광체는 여러 개의 점으로 잘못 해석되지 않습니다. 유도 방출 고갈 (STED)는 촬상 매우 선택적 촛점 여진 8, 필요한 주사를 통해 초 해상도를 허용하면서접근 방식은 뷰의 전체 세포 분야에 걸쳐 속도가 느려질 수 있습니다. STED는 또한 공핍 빔의 전력의 증가로 더 높은 해상도에 대한 상당한 광독성을 보여준다.
구조화 된 조명 현미경 (SIM 9) 표준 형광 현미경의 해상도를 배가시킬 이러한 방법에 대한 대안을 제공하며, 현재의 기술보다 SMLM 생균 이미징에 더 잘 호환된다. 그것은보기의 전체 세포 분야에 대한 폭 넓은 필드 시스템에서 낮은 레이저 파워를 사용합니다; 수집 속도를 증가 및 표준 형광 라벨와 호환 제공한다. SIM의 와이드 필드 자연 또한 <100 nm 인 축 방향 치수의 침투 깊이가 매우 선택적 음원 정보 전반사 형광 (TIRF)의 이용을 허용한다.
화상 상관 분광법 (ICS)의 형광 강도의 변동을 상관하는 방법이다. ICS의 진화; 시공간 메신저나이 상관 분광법 (STICS 10)는 시간과 공간의 세포 내 형광 신호의 상관 관계. 상관 함수를 통해 후행 프레임의 화소를 주변 화소로 강도를 상관시킴으로써, 정보 흐름의 속도 및 방향성에 대하여 얻어진다. 정적 오브젝트 STICS 분석을 방해하지 않도록하기 위해, 부동 오브젝트 필터는 픽셀 세기들의 이동 평균을 뺌으로써 작동되는, 구현된다.
여기에 제시된 기술은 생균 11 분자 흐름을 계량하는 수퍼 – 해상도 현미경 데이터에 적용되는 화상 상관 분광법 제 데모 것으로 여겨진다. 이 방법은 STICS 분석 12 통해 F 액틴 흐름의 회절 제한된 촬상에 향상시키고 광의 회절 한계를 넘어 공간 해상도에서 획득 된 데이터로부터, 생균의 이차원 분자 유동을 결정하고자하는 연구자 맞게 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술은 이미지에 대한 연구를 허용하고 형광을 발현하는 세포에서 이전에 확인할 수없는 정보를 정량화한다. 본 연구 결과에서는 F-T는 액틴 세포는 IS에 셀 중심쪽으로 셀 주변에서 대칭으로 흐르는 것을 보여준다. 이러한 결과는 1D 라인 프로파일 kymograph 데이터 (13)로부터 이전의 결과와 일치하며, 2D 및 초 – 해상도 데이터의 분석 능력을 확장한다.
제시된 기술은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada’s Discovery Grant program.
Materials
| Consumables: | |||
| Jurkat E6.1 cells | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| Penicillin-Strepromycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8-well Labtek coverslips | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP construct | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| anti-CD3 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| anti-CD28 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| Lens oil | |||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment: | |||
| Gene Pulsar Xcell System | BioRad | 165-2660 | |
| Cuvette (0.4cm) | BioRad | 165-2088 | |
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| Centrifuge (Heraeus) | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Stage-top incubator | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM microscope | Nikon | Contact company | |
| Nikon Analyse software | Nikon | Contact company | |
| Incubator (190D) | LEEC | Contact company |
References
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