على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ
Summary
Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Abstract
على نطاق واسع المجهر الإلكتروني 2D (EM)، أو nanotomy، هو تطبيق على مستوى الأنسجة المجهر قرار النانو الإلكترون. الآخرين ونحن تطبيقها من قبل EM على نطاق واسع على الجلد الجزر البنكرياسية الإنسان، وزراعة الأنسجة وكلها اليرقات الزرد 1-7. نحن هنا تصف طريقة تطبيق عالميا لEM مسح الأنسجة النطاق للكشف عن متحيز من الميزات الفرعية الخلوية والجزيئية. تم تطبيق Nanotomy للتحقيق في صحة جيدة والدماغ الزرد الاعصاب. ويستند أسلوبنا على بروتوكولات إعداد نموذج موحد EM: الارتباط مع غلوتارالدهيد والأوسيميوم، تليها التضمين-راتنجات الايبوكسي، سامسونج باجتزاء وتصاعد من سامسونج المقاطع على شبكات حفرة واحدة، يليه آخر تلطيخ مع اليورانيل والرصاص. يتم الحصول على نطاق واسع صور 2D EM الفسيفساء باستخدام المسح EM متصلة مساحة واسعة مولد مسح خارجي باستخدام EM نقل المسح الضوئي (STEM). على نطاق واسع صور EM وعادة ما تكون ~ 5-50 G بكسل طحجم ن، وأفضل عرضها باستخدام ملفات HTML زومابلي، التي يمكن فتحها في أي متصفح ويب، على غرار الخرائط الجغرافية HTML على الانترنت. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لأنسجة (الإنسان)، المقاطع العرضية من الحيوانات كلها وكذلك زراعة الأنسجة 1-5. هنا، تم تحليل أدمغة الزرد في غير الغازية نموذج الاجتثاث الخلايا العصبية. نحن تصور داخل الأنسجة واحدة مجموعة البيانات الخلوية والتغيرات التحت خلوية والتي يمكن قياسها كميا في مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، الضامة في الدماغ. وبالإضافة إلى ذلك، nanotomy يسهل ارتباط EM مع المجهر الضوئي (كليم) 8 على النسيج نفسه، ومساحات كبيرة تصويرها سابقا باستخدام المجهر الفلورسنت، ويمكن بعد ذلك أن يخضع لمساحة واسعة م، مما أدى إلى نانو التشريح (nanotomy) من الأنسجة. في كل شيء، nanotomy يسمح كشف متحيز من الميزات على مستوى EM بطريقة قابلة للقياس على مستوى الأنسجة.
Introduction
وتحسنت التطورات التقنية الأخيرة براعة، تطبيق والطبيعة الكمية للEM، مما يؤدي إلى إحياء تحليل التركيبية. وتشمل التطورات 3D EM، على نطاق واسع 2D EM وتحسين أساليب والكاشف لمترابط المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني (كليم) لمقارنة وسائل أخرى للتحليل مجهري مباشرة إلى المستوى EM 8-10. واسعة النطاق 2D EM هو مناسبة خاصة لقياس أو تحديد (رواية) ميزات المرض لعلم الأمراض البشرية، ودراسة نماذج حيوانية لنماذج المرض وزراعة الأنسجة. ويرجع ذلك إلى حقل صغير عادة النظر أنه من الصعب ربط التغيرات في تضخم عالية على نطاق واسع الأنسجة، وكذلك لتحليل unbiasedly وكميا الخصائص التركيبية.
لتحليل المرضي من الأنسجة البشرية أو تقييم علم الأمراض في النماذج الحيوانية، haematoxylin ويوزين (H & E) الملونة أقسام الفورمالديهايد البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من (FFPE) تيسمقاضاة هو المعيار. وعلاوة على ذلك بسيط يتم تنفيذ H & E تلطيخ immunolabeling أيضا لتحديد التشوهات المرضية. إذا يمكن تحليل هذه الأنسجة على مستوى EM، أنواع معينة من الخلايا، ويمكن تحديد التغييرات التحت خلوية. طبيعة مشاركات من EM على نطاق واسع يسمح إيجاد ميزات غير متوقعة وجديدة من المرض. من قبل على نطاق واسع والمناطق EM يصل إلى ملليمتر مربع يمكن تصور. نحن وغيرنا nanotomy إلى الفئران الجزر البنكرياسية 4، ثقافة الخلية 2، 3 دماغ الفئران، والجلد والغشاء المخاطي 7 وكلها اليرقات الزرد 1،5 (www.nanotomy.org) تطبق سابقا. الزرد هي مناسبة جدا للتصوير في الجسم الحي، في بخاصة لتصور أنواع الخلايا التي يصعب الوصول إليها في أنسجة الثدييات بما في ذلك الدماغ الخلايا المناعية 11. هنا يتم وصف الإجراء nanotomy في التفاصيل، وتطبيقها على أقسام الاكليلية من رؤساء الزرد تمر الاجتثاث الخلايا العصبية المشروط تحويل ميترونيدازول من العصبيةوأعرب nitroreductase (www.nanotomy.org) 5،12-14. يتم تقديم جميع البيانات الخام على شكل ملفات HTML زومابلي، تصور الجزيئية للتغيرات على نطاق والأنسجة. عرض البيانات الخام يسمح التحليلات مشاركات من مجموعات البيانات من زوايا أخرى من قبل خبراء في جميع أنحاء العالم.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM يسمح تحليل السياق الخليوي مع القرار التصوير عالية من الجزيئات في سياق البيولوجي. ومع ذلك، وهذا يحد عادة من مجال الرؤية. نطاق أوسع 3D EM هو مناسبة خاصة لربط الخرائط العصبية من خلال خلق قرار النانو 3 إعادة البناء الأبعاد، تتطلب معالجة البيانات المعقدة 10. في المقابل، 2D على نطاق واسع EM يتطلب سوى مقطع واحد وخياطة من البيانات التصوير، وتقييم البيانات ممكنا من قبل أي شخص من الوصول إلى مستعرض إنترنت. نحن وغيرنا المستخدمة سابقا EM على نطاق واسع لتحليل الأنسجة والحيوانات كلها. أما بالنسبة لمعظم النهج، تيم وخياطة أساس SEM-لا مزاياها. هنا، نقل مسح EM (STEM) والمستخدمة التي تتيح توليد حقل كبير للعرض بدقة عالية. عادة، صورة STEM واحد ما يعادل مجالات عرض ما يقرب من 100 صورة تيم، والحد بشكل كبير من كمية خياطة عند التصوير ملعب لكبيرس النظر بدقة عالية. إذا كانت هناك حاجة دقة أعلى، قد يكون من المفيد تيم. STEM لديه ميزة على تيم ان العينات غير يتناقض يمكن استخدامها مع تباين التركيبية جيد 6.
بالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا يمكن تعديلها ببساطة للاستخدام مع الظهر المنتشرة كشف الإلكترون (BSD) على شنت أقسام على رقائق السيليكا، وتوسيع نطاق استخدام نظم المجهر متعددة. الأنسجة HTML زومابلي الملفات EM هي مفيدة جدا لتقدير، وتبادل البيانات التي قد لا يتم تحليلها لمضمونها الكامل، والجمع بين LM والبيانات EM (كليم) 8، أغراض العرض في مجال البحث العلمي، لتحليل بيانات المرضى، والتعليم. بدلا من ذلك، في EM على نطاق واسع في وزارة شؤون المرأة، ولكن ليس في تيم، رقائق السيليكا يمكن استخدامها، والذي فقد اثنين من المزايا الرئيسية: BSD يمكن استخدامها، والذي يتوفر على المجاهر الإلكترونية المسح الضوئي من STEM الكشف بشكل عام. ثانيا، تصاعد قطاعات كبيرة (> 1 مم 2 مجالاتالفائدة) واضح ومباشر. تصاعد على شبكات فترة زمنية محددة واحدة إلى عمالة كثيفة وصعبة من الناحية التقنية. هو مفصل مقارنة تفصيلية بين تيم، ووزارة شؤون المرأة وSTEM في أي مكان آخر 6. عيوب التصوير BSD هو أنه، مقارنة STEM، زادت الصور الضوضاء. وهذا يمكن أن يعوض جزئيا عن طريق زيادة الوقت بكسل يسكن، مما أدى في مرات الحصول أطول من ذلك بكثير.
على الرغم من أن لتحضير العينات وتجهيز قياسي نسبيا EM (التثبيت، وتضمين وباجتزاء) هناك حاجة إلى 5-7، فمن الصعب فنيا لخفض أقسام سامسونج كبيرة خالية تماما من القطع الأثرية. أقسام هشة جدا، وكسر بسهولة، أضعاف أو دمرت أثناء التصوير، والتي عادة ما يستغرق ساعات عدة في البيانات. ومع ذلك، بسبب المشاركة عبر الإنترنت من بيانات مشاركات الخام، فإنه ينبغي أن يصبح من الممكن مقارنة بسهولة أكبر إلى البيانات المنشورة، واستخدام بيانات نشرت في المجال مفتوح والضوابط. حاليا، عدد قليل من الأجهزة EM قادرة على لوس انجليستحليل RGE على نطاق وقيد الاستخدام، وبالتالي الوصول إلى هذه التقنية محدودة نوعا ما، رغم أن معظم مراكز التصوير ترحب الجهود التعاونية.
لأقسام واسعة النطاق الأنسجة يجب أن تكون ثابتة بشكل صحيح في جميع أنحاء العينة. وهذا هو السبب يتم استخدام خليط من تثبيتي بسرعة ولكن معتدل PFA في تركيبة مع GA بطيء ولكنه قوي تثبيتي. قطع والتقاط أجزاء كبيرة من دون القطع الأثرية أمر صعب. العمل مع رقائق في تركيبة مع BSD هو أسهل مقارنة مع جمع المقاطع على شبكات حفرة واحدة. آخر المعادن الثقيلة تلطيخ أكثر خطورة مقارنة EM الكلاسيكية. حيث يتم تصوير الفرع بأكمله كل قطعة أثرية سوف تكون واضحة. المستخدمين تيم تجد عادة صعوبة في التحول إلى وزارة شؤون المرأة، وذلك بسبب الفرق في عملية المجهر.
الكمي وتبادل البيانات – تحديد مقدار الميزات التحت خلوية من الصعب في الصور EM واحدة. إمكانية التكبير والتصغير واسعة النطاقالصور يسمح بسهولة تحديد خلايا الفائدة، والتي يمكن أن تتبعها القياسات النانوية داخل الخلايا. وتشير هذه المجموعات أن أنواع معينة من الخلايا يمكن التعرف بسرعة وكميا بطريقة غير متحيزة في هذه المقاطع الأنسجة كبيرة، على أساس الخصائص للكشف على مختلف المستويات. ويمكن التعرف على سبيل المثال الخلايا الدبقية الصغيرة القائمة على التشكل والسيتوبلازم الكثيفة. وفي وقت لاحق، على التكبير على الخلايا الفردية، وميزات النانوية التحت خلوية وجزيئية من هذه الخلايا يمكن قياسها ضمن نفس مجموعة البيانات، كما فعلنا في السابق لعرض ER ضمن نطاق واسع الأنسجة EM الثقافة مجموعة البيانات 2. ميزة إضافية من nanotomy هي أن استضافة مجموعات البيانات على نطاق واسع على الانترنت وسوف تسمح للآخرين أن تفقد البيانات، ربما لغيرها من الميزات، واستخلاص النتائج على فرضية جديدة.
كليم – بالإضافة إلى تسهيل EM الكمي، كبير EM على نطاق ويجعل من الاسهل لربط microsco خفيفةالموافقة المسبقة عن علم العلامات على مستوى EM 8. في المثال الحالي يظهر وجود الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية في نموذج الاجتثاث الزرد. والسؤال الكبير في علم الأعصاب هو ما المهام الفردية والمساهمات من الخلايا الدبقية الصغيرة وغيرها من المصادر المحتملة للأكلة والخلايا المناعية. وقد أظهرت الدراسات EM مبكرة ميزات التحت خلوية مميزة من الخلايا الدبقية الصغيرة في مرض 18. لسوء الحظ، فإنه من الصعب تسمية انتقائي الخلايا الدبقية الصغيرة على وجه الخصوص في إعداد المرضية، كما أنها تظهر تداخل كبير مع خلايا مناعية أخرى في التعبير الجيني، مورفولوجيا وظيفة. ولذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت وعندما تختلف الخلايا الدبقية الصغيرة على مستوى التركيبية من الخلايا المناعية من مصادر أخرى بما في ذلك الوحيدات المستمدة التسلل الضامة. فهم ما إذا كانت هناك اختلافات التركيبية بين هذه الخلايا وتوفير نقطة انطلاق لتحليل الفروق الوظيفية. الجمع الانتقائي المعدلة وراثيا أو التعبير علامات وكليم يسمح ديتection من الميزات التركيبية انتقائية لفئات معينة من السكان.
التشخيص والعرض والتعليم – من خلال وضع تصور النانو لالميكروسكيل ضمن البيانات بيانات EM واحد مما يسهل إلى حد كبير لجمهور واسع. مع زيادة إمكانيات وأدوات لEM مترابط وعلى نطاق واسع، فإننا نتوقع انتعاش EM في البحوث الأساسية والطبية. يتم تطبيق أسلوبنا الممثلة هنا إلى نموذج إصابة الزرد الدماغ 5، ولكن تم استخدامها في الأنسجة البشرية 7، دماغ الفئران 3، في نموذج الفئران لمرض السكري (4) وفي زراعة الخلايا 2، ويمكن أن تستخدم أيضا في تركيبة مع تيم النهج القائم 1 تظهر براعة هذا الأسلوب. لم يعد التسجيل المختار المشغل المجهر للغاية، وبالتالي الصور المتحيزة، ولكن يتم تسجيل كافة الميزات التركيبية عديدة ومفتوحة للتحليل في جميع أنحاء العالم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تنفيذ معظم الأعمال في المجهر والتصوير مركز UMCG (UMIC)، الذي ترعاه NWO 175-010-2009-023 وZonMW 91111006. موطني "وادي المجهر 12718" لBNGG. وقد رعت هذا العمل من خلال منحة ZonMW شفني، وماري كوري منحة التكامل الوظيفي (إنقاذ الموت الخلايا العصبية) والزمالة الزهايمر هولندا إلى TJvH
Materials
| Chemicals | |||
| Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
| Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
| Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
| Lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| Atlas external scan generator | Fibics |
References
- Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
- Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
- Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
- van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
- Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
- Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
- Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).
