Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

L'HIV-1 epidemia continua ad avere un impatto significativo in tutto il mondo. A partire dal 2013, circa 35 milioni di persone in tutto il mondo vivevano con l'HIV, e 2,1 milioni di questi erano individui contagiati ^1. Le strategie di prevenzione e un maggiore accesso alla terapia antiretrovirale sono stati utili nel ridurre l'acquisizione complessiva di HIV. Tuttavia, singole popolazioni stanno ancora sperimentando aumenti per l'acquisizione di ^HIV-1. Quindi, vi è la necessità di proseguire gli sforzi per affrontare questa epidemia.

Uno dei più forti predittori di progressione della malattia da HIV è attivazione immunitaria cronica (CIA) ^2-10. Definito da persistentemente elevati livelli di citochine rilevabili e marcatori di espressione elevati sulla superficie dei linfociti T, CIA è stato attribuito a: i) continua la produzione di cellule dendritiche di tipo I IFN ^11; (ii) l'attivazione immunitaria diretta guidata da proteine ​​dell'HIV Tat, Nef e gp120 ^12; (iii) Traslocazione di proteine ​​batteriche intestinali associate a cellule immunitarie ^6. Tuttavia, il meccanismo esatto (s) cronica sottostante, l'attivazione immunitaria sistemica nell'infezione da HIV devono ancora essere completamente chiariti.

Il nostro gruppo di ricerca e altri hanno dimostrato un ruolo di esosomi HIV patogenesi ^15-18. Il nostro gruppo ha stabilito che la proteina Nef è escreto dalle cellule infette in esosomi ^15, e exosomal Nef (exNef) è presente nel plasma di individui affetti da HIV a livelli nanogrammi ^18. Abbiamo dimostrato che astante CD4 + T-cellule esposte a exNef provocato attivazione indotta morte cellulare dipendente dal percorso CXCR4 ^{19, 20.} In alternativa, monociti / macrofagi erano refrattari all'apoptosi exNef indotta, ma esposto funzioni cellulari alterati e di espressione di citochine. Esosomi Più di recente, il nostro gruppo ha dimostrato isolate dal plasma di individui affetti da HIV contengono una varietà di citochine pro-infiammatorie. Further, ingenui cellule mononucleate del sangue periferico esposti a exosomes plasmaderivati ​​da pazienti con infezione da HIV indotta espressione di CD38 sulle cellule memoria ingenuo e centrale CD4 + e CD8 + T. Ciò probabilmente contribuisce ad infiammazione sistemica e la propagazione virale tramite l'attivazione delle cellule astante ^21, e suggerisce che esosomi giocano un ruolo importante nella patogenesi dell'HIV.

Nel indagare il ruolo di esosomi nella patogenesi dell'HIV, una sfida sta sviluppando tecniche per esosomi efficacemente separati da particelle di HIV, pur mantenendo il contenuto exosomal così come la loro capacità funzionale modulazione immunitaria. Diversi metodi sono stati descritti per isolare esosomi da coltura cellulare e fluidi biologici ^22,23. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità (esosomi galleggiare con una densità di 1,15 – 1,19 g / ml), ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l'isolamento exosome ^23.Tuttavia, con infezione da HIV supernatanti di coltura cellulare e nel plasma dei pazienti contengono sia esosomi e HIV-1 particelle virali. Esosomi e HIV-1 particelle sono molto simili per dimensioni e densità. In alternativa, sfruttando l'espressione di marcatori exosomal unici come CD63, CD45, CD81 e, esosomi sono stati isolati con metodi di cattura immunoaffinità ^23. Questa procedura può separare il virus da esosomi. Tuttavia, l'inconveniente di questa tecnica è la stretta attaccamento di anticorpi purificati esosomi, che potrebbero interferire con la valutazione del potenziale immunomodulante di esosomi in coltura.

Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una procedura per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano modificati rispetto Cantin e collaboratori ²² utilizzando iodixanolo gradienti di velocità. Esosomi sono stati trovati a segregare in bassa densità / frazioni superiori di gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali separati nel altadensità / frazioni inferiori. Particelle virali sono stati identificati da p24 ELISA e esosomi sono stati identificati utilizzando marcatori exosome AChE, CD9, CD63, CD45 e. Le frazioni a bassa densità superiori raccolti contenevano esosomi che erano negativi per la contaminazione da HIV-1 p24. La purificazione efficiente e la separazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano permette di accurato esame del contenuto di esosomi derivati ​​dal plasma umano e l'indagine del loro potenziale modulatore immunitario e il valore diagnostico e prognostico di esosomi in HIV-1 patogenesi.