Un enfoque semi-automatizado de preparación de cócteles de anticuerpos para el Análisis Inmunofenotípicos de la sangre periférica humana
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
El inmunofenotipo de sangre periférica por citometría de flujo determina los cambios en el estado de la frecuencia y la activación de los leucocitos periféricos durante enfermedad y el tratamiento. Tiene el potencial para predecir la eficacia terapéutica e identificar nuevas dianas terapéuticas. tinción de sangre entera utiliza la sangre no manipulada, lo que minimiza los artefactos que pueden ocurrir durante la preparación de la muestra. Sin embargo, toda la tinción de sangre también se debe realizar en la sangre recién recogida para asegurar la integridad de la muestra. Además, lo mejor es preparar los cócteles de anticuerpos en el mismo día para evitar la posible inestabilidad del tándem de colorantes y evitar la interacción entre el reactivo de tintes violetas brillantes. Por lo tanto, toda manchas de sangre requiere una cuidadosa estandarización para controlar la variabilidad intra e inter-experimental.
Aquí, se presenta la implementación de un manipulador de líquidos automatizado equipado con un (2D) lector de código de barras de dos dimensiones en un proceso estándar de hacer antibodY cócteles para citometría de flujo. Los anticuerpos se transfirieron a tubos de código de barras 2D dispuestos en un formato de 96 pocillos y sus contenidos en una base de datos compilada. El manipulador de líquidos podría entonces localizar los viales de anticuerpos fuente haciendo referencia a nombres de anticuerpos dentro de la base de datos. Nuestro método elimina la coordinación tedioso para el posicionamiento de los tubos de anticuerpos de origen. Proporcionó versatilidad permite al usuario cambiar fácilmente cualquier número de detalles en el proceso de dispensación de anticuerpo tal como un anticuerpo específico de usar, el volumen, y de destino mediante la modificación de la base de datos sin volver a escribir las secuencias de comandos en el método de software para cada ensayo.
Un experimento de prueba de concepto alcanza la precisión del análisis inter e intra excepcional, demostrado por la preparación de una réplica de 11 colores, flujo 17-anticuerpo ensayo de citometría. Estas metodologías se incrementaron el rendimiento global para citometría de flujo ensayos y facilitaron la preparación diaria de los cócteles de anticuerpos complejos requeridos para el fenotipo detalladaCaracterización typic de sangre periférica anticoagulada recién recogida.
Introduction
Fenotipo inmune de la sangre periférica humana determina los cambios cuantitativos y cualitativos en subconjuntos de células inmunes 1. Proporciona información sobre los mecanismos de acción y resistencia, el descubrimiento de biomarcadores predictivos ayudas, y facilita el desarrollo de inmunoterapias combinación. Por lo tanto, la validación y estandarización de immunophenotyping es un área de gran interés para los investigadores académicos, laboratorios clínicos, y las industrias.
Aunque inmunofenotipo de sangre periférica mediante métodos de citometría de flujo se utiliza actualmente para la gestión clínica de los tumores malignos hematológicos 2,3 y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), 4,5 inmunofenotipo fiable de la sangre periférica para las demandas de inmunoterapia consideraciones específicas en la validación y estandarización porque requiere una cobertura más amplia sobre subconjuntos de células inmunes y / receptores inhibidores de activación 1,6-8. succeimmunophenotyping ssful requiere la estandarización cuidadosa para minimizar la variabilidad-experimento a experimento relacionado con la configuración del instrumento y el procedimiento de tinción de células 9,10. Mientras que la normalización de los ajustes del instrumento para citometría de flujo está bien establecido para hacer frente a la antigua preocupación 9,11,12, no queda claro cómo minimizar la variabilidad relacionada con la tinción de células sin restringir la cobertura de subconjuntos de células inmunes y su estado de activación.
Como el número de antígenos a detectar aumenta, también lo hace la posibilidad de error y la variabilidad debido a la dispensación de reactivo subóptima y la contaminación cruzada. Métodos para el análisis phenoptypic de sangre entera anticoagulada se establecieron en la década de 1980 para su uso en ensayos de laboratorio clínico. Estos mismos métodos satisfacen las necesidades de los laboratorios de investigación para la preparación de la muestra. Es importante destacar que los cócteles de anticuerpos utilizados en el laboratorio clínico son típicamente menos complejo y available pre-tituló y se pre-mezclado del fabricante. Sólo se requiere una única transferencia de la mezcla de anticuerpos pre-mezclado. En el marco de la investigación, los cócteles de anticuerpos de 10-16 anticuerpos son típicos. Cada cóctel debe ser validado por la estabilidad por el laboratorio o preparado fresco antes de cada ensayo. Preparación de múltiples mezclas de anticuerpos para una muestra podría comportar el pipeteo de 50-80 anticuerpos individuales, una tarea que es tedioso y propenso a errores.
La automatización de la preparación de cócteles tiene varias ventajas sobre la preparación de cócteles manual, tal como menos errores, mayor precisión de pipeteo, y posiblemente incluso la disminución del desperdicio de reactivo. Aquí, se presenta la introducción exitosa de un manipulador de líquidos automatizado equipado con un (2D) lector de código de barras de dos dimensiones en el proceso de tinción celular de immunophenotyping para minimizar la variabilidad relacionada con la preparación de la muestra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fenotipo inmune de sangre periférica es de importancia crítica para la promoción de conocimientos sobre las respuestas individuales a la inmunoterapia. El desafío consiste en la normalización de ensayo para el control de experimento a experimento 1,14 variabilidad. Una fuente principal de variabilidad reside en la manipulación humana de las muestras. Por lo tanto, es concebible que la automatización parcial o total de procesamiento de la muestra facilitará una dramática reducción en la variabilidad 1,14-experimento a experimento. En este protocolo, nos informan de nuestro esfuerzo exitoso para reducir al mínimo la variabilidad del ensayo mediante la introducción de un manipulador de líquidos automatizado equipado con lector de código de barras 2D para la tinción de muestras de sangre en todo el inmunofenotipo.
En el diseño, la aplicación de este método es muy versátil y puede supervisar otros subconjuntos inmunes adicionales mediante la adición de "cócteles Base" para definirlos. Tales subconjuntos incluyen células T auxiliares, células reguladoras T, células B, células NK, células dendríticas, y monocitos (manuscrito enpreparación) 18. Hemos adaptado paneles de anticuerpos recomendados por el consorcio mediante la introducción de marcadores adicionales 1. Las poblaciones celulares se identificaron utilizando "Cocktail Base" conjugado con fluorocromos con emisiones mínima en el brillante violeta 421 (BV421), ficoeritrina (PE), y aloficocianina (APC) detectores, ya que queríamos reservar estos canales para la detección de antígenos inducibles. Esta característica no sólo asegura la más alta sensibilidad para monitorizar el estado de activación de las células inmunes sino que también permite un alojamiento flexible de nuevos marcadores de activación como estos tres fluorocromos están más frecuentemente conjugarse con anticuerpos contra marcadores inducibles. Por lo tanto, nuestro método no sólo es adecuado para la preparación de cócteles para toda inmunofenotipo de sangre, pero también es útil para la tinción de otras muestras, incluyendo las células mononucleares de sangre periférica y células recuperadas a partir de tejidos desglosados (por ejemplo, tumor).
introducción exitosaproducción de nuestro método requiere una atención especial a los pasos en la preparación de material de laboratorio, y la programación y la ejecución del método. Preparación de los tubos de códigos de barras 2D incluye etiquetado con etiquetas legible por humanos y la transferencia de los anticuerpos a los tubos designados. Para evitar la introducción de errores, se recomienda hacer esto con dos personas. Siempre que el cambio de hojas de cálculo, los investigadores deben verificar si el método funciona correctamente. La elección de los métodos de pipeteo adecuadas durante la programación asegura la transferencia de líquido éxito. LLS permite pipeteo sin que los desechos se precipitó desde el fondo de los tubos de anticuerpos, para los que usamos ya sea P50 o P200 puntas conductoras. LLS puede no ser una buena opción para las extremidades P1000 como LLS es más sensible con puntas P1000 y, a veces falsamente provocada por la presencia de burbujas. Heights en la definición de material de laboratorio deben ajustarse para cada instrumento podría ocurrir la transferencia de líquido como subóptima, por ejemplo, si no hay suficiente espacio entre el borde de las puntasy la parte inferior de los tubos. Como se muestra en la Figura 12, si el "Cocktail Base" y / o "Cóctel de activación" No se agitaron bien, esto puede resultar en manchas subóptima.
Pensamos sobre el uso de los reactivos liofilizados para la tinción de células como un enfoque alternativo para reducir la variabilidad relacionada con la dispensación de reactivo 19. Sin embargo, se conocen conjugados poliméricos de tintes violetas brillantes para interactuar unas con otras señales no específicas que causan. Como tal, la adición de más de dos conjugados poliméricos (por ejemplo, BV421 y BV650, etc.) en los reactivos liofilizados pueden causar la señalización no específica (por ejemplo, aumento de la señal de fondo BV650 en BV421 + población) 20. Por otra parte, los reactivos liofilizados carecen de flexibilidad para la inclusión de nuevas manchas. Por lo general son más caros y requieren una orden a granel. Por estas razones, se optó por utilizar el manipulador de líquidos automatizado equipado con los tubos de códigos de barras 2D. A pesar de que tcopos de tiempo para configurar y conlleva una inversión inicial para comprar el instrumento, a la larga, serán compensados por factores tales por el aumento de la productividad y la reproducibilidad de los ensayos. De hecho, algunos grupos se informó anteriormente la integración exitosa del manipulador de líquidos automatizado en su flujo de trabajo de immunophenotyping o aplicaciones similares 21,22. soluciones automatizadas para el análisis de citometría de flujo también están disponibles a partir de fuentes comerciales (FACS SPA III, Cóctel de preparación automática de estaciones de trabajo, y FlowStainer). Esto indica además que hay una gran necesidad para la preparación de cócteles automatizado para determinar el inmunofenotipo.
Después de dominar esta técnica, prevemos que el desarrollo de totalmente automatizado immunophenotyping sangre entera reducirá aún más la variabilidad del experimento a experimento y podría hacer que toda la sangre immunophenotyping factible, incluso en un entorno de 23 ensayo clínico multicéntrico. Ya hemos comenzado a utilizar un Lyse erah asistente para automatizar los pasos de lisis y lavado. también Prevemos que la determinación automatizada del volumen de anticuerpo en los tubos de códigos de barras 2D y el seguimiento de dispensación de reactivo mejorará en gran medida el inventario de anticuerpos y el control de calidad de nuestro método, respectivamente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
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