Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immunphänotypisierung von peripheren Blutfluss durch Zytometrie bestimmt Änderungen in der Frequenz und Aktivierungsstatus peripherer Leukozyten während Krankheit und Behandlung. Es hat das Potenzial therapeutische Wirksamkeit vorherzusagen und neue therapeutische Targets zu identifizieren. Vollblut-Färbung verwendet unmanipulierte Blut, die Artefakte minimiert, die während der Probenvorbereitung auftreten können. Allerdings müssen Vollblut Färbung auch auf frisch gesammelte Blut durchgeführt werden, die Integrität der Probe zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es am besten, Antikörper-Cocktails am selben Tag zu bereiten potentielle Instabilität von Tandem-Farbstoffe zu vermeiden und Reagenz Interaktion zwischen brillanten violetten Farbstoffe verhindern. Daher erfordert Vollblut-Färbung vorsichtig Standardisierung für Intra- und Inter-experimentellen Variabilität zu steuern.
Hier berichten wir Bereitstellung eines automatisierten Liquid Handler mit einem zweidimensionalen (2D) Barcode-Leser in einem Standardprozess Antibod macheny Cocktails für die Durchflusszytometrie. Die Antikörper wurden in Röhrchen mit Barcode 2D in einer 96-Well-Format angeordnet übertragen und deren Inhalte in einer Datenbank zusammengestellt. Das Liquid Handler könnte dann die Quell Antikörper Fläschchen finden, indem Sie in der Datenbank Antikörper Namen referenzieren. Unsere Methode eliminiert langwierige Koordination für die Positionierung der Quelle Antikörper Rohre. Vorgesehen Vielseitigkeit ermöglicht dem Benutzer, auf einfache Weise eine beliebige Anzahl von Details in den Antikörper Abgabevorgang ändern, wie beispielsweise spezifische Antikörper zu verwenden, Volumen und Ziel durch die Datenbank zu modifizieren, ohne für jeden Test die Skript in dem Softwareverfahren neu zu schreiben.
Ein Proof of Concept-Experiment erreicht hervorragende inter- und intra Assay-Präzision, demonstriert durch wiederholte Herstellung einer 11-Farben-17-Antikörper Durchflusszytometrie-Assay. Diese Methoden erhöht den Gesamtdurchsatz für die Durchflusszytometrie Assays und täglich Herstellung des Komplexes Antikörper-Cocktails, die für die detaillierte pheno erleichterttypic Charakterisierung von frisch gesammelten antikoaguliertem peripherem Blut.
Introduction
Immunphänotypisierung von menschlichen peripheren Blut bestimmt quantitative und qualitative Veränderungen der Immunzelluntergruppen ein. Es gibt einen Einblick in Wirkmechanismen und Widerstand, unterstützt Entdeckung prädiktiver Biomarker, und erleichtert die Entwicklung von Immuntherapien Kombination. Daher ist die Validierung und Standardisierung von Immunophänotypisierung ein Gebiet von großem Interesse für die akademische Forschung, klinische Labors und Industrie.
Obwohl Immunphänotypisierung der peripheren Blut durch Durchflusszytometrie-Verfahren ist derzeit für die klinische Behandlung von hämatologischen Malignitäten verwendet 2,3 und Human Immunodeficiency Virus (HIV) 4,5, zuverlässige Immunphänotypisierung der peripheren Blut für die Immuntherapie Anforderungen spezifischen Überlegungen bei der Validierung und Standardisierung, weil es erfordert umfassendere Berichterstattung über Immunzelluntergruppen und die Aktivierung / inhibitorische Rezeptoren 1,6-8. successful Immunophänotypisierung erfordert eine sorgfältige Standardisierung Experiment zu Experiment Variabilität Geräteeinstellung und die Zelle Färbeverfahren 9,10 Bezug zu minimieren. Indem die Standardisierung von Geräteeinstellungen für die Durchflusszytometrie gut etabliert ist die ehemalige Sorge 9,11,12 anzugehen, bleibt es unklar, wie Variabilität Zellfärbung ohne Einschränkung Abdeckung der Immunzelluntergruppen und deren Aktivierungsstatus im Zusammenhang zu minimieren.
Da die Anzahl von Antigenen erhöht erkannt werden, tut dies auch die Möglichkeit für Fehler und Variabilität zu suboptimalen Reagenzabgabestation wegen und Kreuzkontamination. Methoden zur phenoptypic Analyse von antikoaguliertem Vollblut wurden in den späten 1980er Jahren für den Einsatz in der klinischen Labortests festgestellt. Dieselben Methoden dienen, die Bedürfnisse des Forschungslabors für die Probenvorbereitung. Wichtig ist, dass die Antikörper-Cocktails im klinischen Labor verwendet typischerweise weniger komplex und Available vorher titriert und vorgemischt vom Hersteller. Nur eine einzige Übertragung von den vorgemischten Antikörper-Cocktail ist nicht erforderlich. In der Forschung Einstellung, sind Antikörper-Cocktails von 10-16 Antikörper typisch. Jeder Cocktail muss für die Stabilität des Labors validiert werden oder frisch zubereitet vor jedem Test. mehrere Antikörper-Cocktails für eine Probe vorbereiten könnte das Pipettieren von 50 bis 80 einzelnen Antikörper mit sich bringen, eine Aufgabe, die sowohl mühsam und fehleranfällig ist.
Automation von Cocktail-Zubereitung mehrere Vorteile gegenüber manuellen Cocktail Vorbereitung wie weniger Fehler hat, erhöhte Genauigkeit von Pipettieren, und möglicherweise sogar gesunken Reagenz Verschwendung. Hier berichten wir über die erfolgreiche Einführung eines automatisierten Liquid Handler mit einem zweidimensionalen (2D) Barcode-Leser in die Zelle-Färbeprozess von Immunophänotypisierung Variabilität zu minimieren bezogene Vorbereitung zu probieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunphänotypisierung der peripheren Blut ist von entscheidender Bedeutung für Einblicke in individuelle Reaktionen auf die Immuntherapie gewinnt. Die Herausforderung liegt in Test Standardisierung Experiment zu Experiment Variabilität 1,14 zu steuern. Eine Hauptquelle der Veränderlichkeit liegt im menschlichen Manipulation von Proben. Daher ist es denkbar, dass eine teilweise oder vollständige Automatisierung der Probenaufbereitung eine dramatische Reduktion in Experiment zu Experiment Variabilität 1,14 erleichtert. In diesem Protokoll, können wir unsere erfolgreichen Bemühungen Assay Variabilität zu minimieren, indem eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungs ausgestattet mit 2D-Barcode-Leser für die Probenfärbung im Vollblut Immunophänotypisierung einzuführen.
Im Design ist unser Verfahren vielseitig und kann durch Hinzufügen zusätzlicher "Basis Cocktails" zu definieren sie andere Immununtergruppen überwachen. Solche Untergruppen umfassen T-Helferzellen, T regulatorischen Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, dendritische Zellen und Monozyten (Manuskript inVorbereitung) 18. Wir passten die empfohlene Antikörper-Panels des Konsortiums durch zusätzliche Marker eingeführt werden 1. Zellpopulationen wurden mit "Basis Cocktail" konjugiert mit Fluorochromen mit minimalen Emissionen in der brillanten Violett 421 (BV421), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) Detektoren identifiziert, wie wir diese Kanäle für den Nachweis der induzierbaren Antigene zu reservieren wollte. Diese Funktion sorgt nicht nur für die höchste Empfindlichkeit Aktivierungsstatus von Immunzellen zu überwachen, sondern ermöglicht auch eine flexible Unterkunft neuer Aktivierungsmarker wie diese drei Fluorochrome werden am häufigsten mit Antikörpern gegen induzierbare Marker konjugiert. Deshalb ist unsere Methode nicht nur für Cocktail Vorbereitung für Vollblut Immunphänotypisierung geeignet, sondern ist auch nützlich zum Anfärben anderen Proben einschließlich peripheren mononukleären Blutzellen und von disaggregierten Gewebe gewonnenen Zellen (zB Tumor).
erfolgreiche IntroHerstellung unserer Methode erfordert den Schritten in Labware Herstellung und Programmierung und Ausführung des Verfahrens besondere Aufmerksamkeit. Herstellung der Rohre 2D-Barcode enthält Markierung mit für Menschen lesbaren Etiketten und Überführen der Antikörper an den dafür vorgesehenen Tuben. Um die Einführung von Fehlern zu vermeiden, wird empfohlen, tun wir das mit zwei Personen. Jedes Mal, wenn Tabellen ändern, sollten die Ermittler prüfen, ob das Verfahren korrekt funktioniert. Die Wahl geeigneter Pipettiermethoden während Programmierung sorgt für erfolgreiche Flüssigkeitstransfer. LLS ermöglicht Pipettieren ohne von der Unterseite des Antikörper Rohre gefällte Schmutz immer, für die wir entweder P50 oder P200 leitfähige Spitzen verwenden. LLS kann nicht eine gute Option für P1000 Tipps, wie LLS empfindlicher mit P1000 Tipps und manchmal fälschlicherweise durch die Anwesenheit von Luftblasen ausgelöst. Heights in Laborgeräte Definition sollte für jedes Instrument als suboptimal Flüssigkeitsübertragung auftreten kann, zum Beispiel eingestellt werden, wenn es nicht genug Platz zwischen dem Rand der Tipps istund die Unterseite der Rohre. Wie in 12 gezeigt, wenn der "Basis Cocktail" und / oder "Aktivierung Cocktail" sind nicht gut verwirbelt, kann es zu einer suboptimalen Flecken führen.
Wir dachten an gefriergetrockneten Reagenzien für die Zellfärbung als Alternative Ansatz zur Reduzierung der Variabilität im Zusammenhang mit Reagenz 19 zu verzichten. Allerdings Polymer-Konjugate von brillanten violetten Farbstoffen sind bekannt mit einander zu verursachen unspezifische Signale zu interagieren. Als solche Zugabe von mehr als zwei Polymer-Konjugate (zB BV421 und BV650 etc.) in lyophilisierten Reagenzien unspezifische Signalisierung verursachen kann (zum Beispiel, Erhöhung der BV650 Hintergrundsignal in BV421 + Bevölkerung) 20. Darüber hinaus fehlt lyophilisierten Reagenzien Flexibilität für neue Färbung einschließlich. Sie sind in der Regel teurer und erfordern einen Großauftrag. Aus diesen Gründen haben wir uns für den automatisierten Liquid Handler mit den Barcode-Rohre 2D ausgestattet zu verwenden. Obwohl es takes Zeit einzurichten und bringt eine Vorab-Investition, das Instrument zu kaufen, wird auf die Dauer solcher Faktoren für die Steigerung der Produktivität und Reproduzierbarkeit von Tests kompensiert werden. In der Tat, berichtet ein paar Gruppen zuvor die erfolgreiche Integration des automatisierten Liquid Handler in ihren Workflow von Immunphänotypisierung oder ähnliche Anwendungen 21,22. Automatisierte Lösungen für die Durchflusszytometrie-Analyse sind auch im Handel erhältlich (FACS SPA III Automatische Cocktail Vorbereitung Workstation und FlowStainer). Dies zeigt, weiter gibt es einen großen Bedarf an automatisierter Cocktail Vorbereitung für Immunphänotypisierung.
Nachdem diese Technik zu beherrschen, stellen wir uns, dass die Entwicklung von vollständig Vollblut Immunophänotypisierung automatisiert wird weiteres Experiment zu Experiment Variabilität reduzieren und könnte Vollblut Immunophänotypisierung möglich sogar in einer multizentrischen klinischen Studie Einstellung 23 machen. Wir haben bereits eine Lyse begonnen Verwendung warh Assistent die Lyse und Waschschritte zu automatisieren. Wir sehen auch, dass automatische Bestimmung des Volumens der Antikörper in den 2D-Barcode-Rohre und die Verfolgung von Reagenzienzugabe stark Inventar von Antikörpern zu verbessern und die Qualität Kontrolle über unsere Methode auf.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
