Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immuunfenotypering van perifeer bloed door stroming cytometrie bepaald veranderingen in de frequentie en activeringsstatus van perifere leukocyten bij ziekte en behandeling. Het heeft de potentie om de therapeutische werkzaamheid te voorspellen en identificeren van nieuwe therapeutische targets. Volbloed kleuring gebruikt ongemanipuleerde bloed, die artefacten die kunnen optreden tijdens de voorbehandeling minimaliseert. Echter, moet volbloed kleuring worden uitgevoerd op vers afgenomen bloed om de integriteit van het monster te verzekeren. Daarnaast is het het beste om antilichaam cocktails bereiden op dezelfde dag om potentiële instabiliteit van tandem-kleurstoffen te voorkomen en te voorkomen dat reagens interactie tussen briljante violette kleurstoffen. Daarom volbloed kleuring vereist een zorgvuldige standaardisatie te controleren voor intra- en inter-experimentele variabiliteit.
Hier melden wij inzetten van een automatische vloeistofhandler voorzien van een tweedimensionale (2D) barcode lezer in een standaard werkwijze voor het maken Antibody cocktails voor flowcytometrie. Antilichamen werden overgebracht in 2D barcodes buizen aangebracht in een 96 putjes en de inhoud verzameld in een database. De vloeistof handler kon ga naar de bron antilichaam flesjes door te verwijzen naar antilichaam namen in de database. Onze methode geëlimineerd vervelend coördinatie voor het positioneren van de bron antilichaam buizen. Het ontvangen flexibiliteit zodat de gebruiker een aantal gegevens in het antilichaam uitloopprocedure gemakkelijk veranderen zoals specifieke antilichamen te gebruiken, volume en bestemming door aanpassing van de symbolen zonder het scripting herschrijven in de software methode voor elke assay.
Een proof of concept experiment behaalde uitstekende inter en intra-assay precisie, gedemonstreerd door repliceren de bereiding van een 11-kleuren, 17-antilichaam flowcytometrie test. Deze methodologieën grotere totale verwerkingscapaciteit voor flowcytometrie assays en vergemakkelijkt dagelijkse bereiding van het complex antilichaam cocktails die voor de gedetailleerde phenotypic karakterisering van vers verzameld anticoagulanteerd perifere bloed.
Introduction
Immuunfenotypering van menselijk perifeer bloed bepaalt kwantitatieve en kwalitatieve veranderingen in immuuncelsubklassen 1. Het geeft inzicht in de mechanismen van de actie en de weerstand, helpt ontdekking van predictieve biomarkers, en faciliteert de ontwikkeling van de combinatie van immuuntherapie. Daarom is de validatie en standaardisatie van immuunfenotypering is een gebied van groot belang voor academische onderzoekers, klinische laboratoria en industrieën.
Hoewel immunofenotypering van perifeer bloed door flowcytometrische technieken die momenteel wordt gebruikt voor klinische behandeling van hematologische maligniteiten 2,3 en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) 4,5, betrouwbare immunofenotypering van perifeer bloed voor immunotherapie eisen specifieke overwegingen bij de validatie en standaardisatie omdat het vereist meer uitgebreide dekking dan immuun cel subsets en activatie / remmende receptoren 1,6-8. successful immunofenotypering vereist een zorgvuldige standaardisatie om experiment tot experiment variabiliteit met betrekking tot instrument setup en de cel kleuring procedure 9,10 minimaliseren. Terwijl de standaardisering van het instrument instellingen voor flowcytometrie is goed ingeburgerd bij de voormalige zorg 9,11,12 te pakken, blijft het onduidelijk hoe de variabiliteit in verband met cel kleuring een minimum te beperken, zonder beperking van de dekking van het immuunsysteem cel subsets en hun activatie-status.
Aangezien het aantal antigenen te detecteren toeneemt, neemt ook de kans op fouten en variabiliteit vanwege suboptimale reagens afgifte en kruisbesmetting. Methoden voor de analyse phenoptypic anticoagulanteerd volbloed werden vastgesteld in de late 1980's voor gebruik in klinische laboratoriumbepalingen. Deze zelfde methodes aan de behoeften van het onderzoekslaboratorium voor de monstervoorbereiding. Belangrijker is het antilichaam cocktails in de klinische laboratoria doorgaans minder complex en available pre-titer en voorgemengde van de fabrikant. Slechts een enkele overdracht van de voorgemengde antilichaam cocktail nodig. In het onderzoek instelling antilichaam cocktails van 10-16 antilichamen typisch. Elke cocktail moet worden gevalideerd voor stabiliteit door het laboratorium of verse vóór elke test voorbereid. Het voorbereiden van meerdere antilichaam cocktails voor een monster kan het pipetteren van 50-80 afzonderlijke antilichamen, een taak die zowel vervelend en foutgevoelig met zich meebrengen.
Automatisering van cocktail voorbereiding heeft een aantal voordelen ten opzichte van handmatige cocktail bereiding, zoals minder fouten, verhoogde nauwkeurigheid van pipetteren, en misschien zelfs afgenomen reagens verspilling. Hier rapporteren wij de succesvolle introductie van een automatische vloeistofhandler voorzien van een tweedimensionale (2D) barcodelezer in de cel-kleuring Werkwijze immuunfenotypering variabiliteit met betrekking tot bereiding van het monster te minimaliseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuunfenotypering van perifere bloed is van cruciaal belang voor het verkrijgen van inzicht in de individuele reacties op immunotherapie. De uitdaging ligt in het assay normalisatie experiment-to-experiment variabiliteit 1,14 beheersen. Een belangrijke bron van variabiliteit ligt in de menselijke manipulatie van monsters. Daarom is het denkbaar dat gedeeltelijk of volledig automatiseren monsterverwerking een drastische vermindering van experiment tot experiment variabiliteit 1,14 vergemakkelijkt. In dit protocol, melden we onze succesvolle inspanningen om assay variabiliteit te minimaliseren door de invoering van een geautomatiseerde vloeibare handler uitgerust met 2D barcode-lezer voor het monster kleuring in volbloed immunofenotypering.
In het ontwerp, onze methode is veelzijdig en kan andere immuunsysteem subsets te controleren door het toevoegen van extra "Base Cocktails" om ze te definiëren. Dergelijke bepaald om T-helpercellen, T-regulerende cellen, B-cellen, NK-cellen, dendritische cellen en monocyten (manuscript invoorbereiding) 18. We aangepast van het consortium aanbevolen antilichaam panelen door de invoering van extra 1 markers. Celpopulaties werden geïdentificeerd met "Base Cocktail" geconjugeerd aan fluorochromen met minimale emissie naar de briljante violette 421 (BV421), fycoerythrine (PE) en allofycocyanine (APC) detectoren, als we wilden deze kanalen te reserveren voor het detecteren van induceerbare antigenen. Deze functie zorgt niet alleen de hoogste gevoeligheid voor activeringsstatus van immuuncellen volgen maar maakt ook flexibele accommodatie nieuwe activatie merkers bij deze drie fluorochromen meest worden geconjugeerd met antilichamen tegen induceerbare merkers. Daarom is onze werkwijze niet alleen geschikt voor cocktail bereiding van bloed immunofenotypering maar is ook bruikbaar voor het kleuren van andere monsters zoals perifeer bloed mononucleaire cellen en cellen gewonnen uit gedifferentieerde weefsels (bijvoorbeeld tumor).
succesvolle introproductie van onze methode vergt speciale aandacht voor de stappen in laboratorium voorbereiding en programmering en uitvoering van de methode. Bereiding van de 2D-barcode buizen omvat labeling met leesbare labels en overdragen van de antilichamen aan de aangewezen buizen. Om de introductie van fouten te voorkomen, raden wij u dit te doen met twee mensen. Wanneer het veranderen van spreadsheets, moeten de onderzoekers nagaan of de methode goed werkt. Het kiezen van de juiste pipetteren methoden tijdens het programmeren zorgt voor succesvolle vloeistof-overdracht. LLS pipetteren maakt zonder dat neergeslagen vuil van de bodem van antilichaam buizen, waarvoor wij zowel P50 en P200 geleidende spuittips. LLS is misschien niet een goede optie voor P1000 tips als LLS is gevoeliger met P1000 tips en soms ten onrechte veroorzaakt door de aanwezigheid van bellen. Hoogtes labware definitie moet worden aangepast voor elk instrument optimaal vloeistoftransport kan optreden, bijvoorbeeld als er onvoldoende ruimte tussen de rand tipsen de onderste buizen. Zoals getoond in figuur 12, als de "Base Cocktail" en / of "Activation Cocktail" niet goed gewerveld, kan dit leiden tot suboptimale kleuring.
We dachten dat over het gebruik van gevriesdroogde reagentia voor cel kleuring als een alternatieve benadering van de variabiliteit in verband met reagens afgeven van 19 verminderen. Echter, polymeerconjugaten briljante violette kleurstoffen is bekend met elkaar waardoor niet-specifieke signalen. Als zodanig toevoegen van meer dan twee polymeer conjugaten (bijvoorbeeld BV421 en BV650 etc.) in gevriesdroogde reagentia kunnen niet-specifieke signalering veroorzaken (bijvoorbeeld toename van BV650 achtergrondsignaal in BV421 + populatie) 20. Bovendien gevriesdroogde reagentia missen flexibiliteit met nieuwe kleuring. Ze zijn meestal duurder en vereisen een massa-orders. Om die redenen hebben we ervoor gekozen om de geautomatiseerde vloeibare handler uitgerust met de 2D barcode buizen gebruiken. Hoewel het takes tijd op te zetten en brengt een investering vooraf om het instrument te kopen, op de lange termijn factoren zal worden gecompenseerd door de verhoogde productiviteit en reproduceerbaarheid van assays. Sterker nog, een paar groepen eerder gemeld de succesvolle integratie van de geautomatiseerde vloeibare handler in hun workflow van immuunfenotypering of soortgelijke toepassingen 21,22. Geautomatiseerde oplossingen voor flowcytometrie analyse zijn ook verkrijgbaar bij commerciële bronnen (FACS SPA III, Automated Cocktail Voorbereiding Workstation en FlowStainer). Dit wijst er verder een grote behoefte aan geautomatiseerde cocktail voorbereiding immunofenotypering.
Na beheersen deze techniek visualiseren we dat de ontwikkeling van volautomatische volbloed immunofenotypering verder zal verminderen experiment tot experiment variabiliteit en misschien volbloed immunofenotypering mogelijk zelfs in een multicenter klinische trial instellen 23 maken. We zijn al begonnen met behulp van een Lyse wash assistent van de lysis en wassen stappen te automatiseren. Wij voorzien dat automatische bepaling van de hoeveelheid van antilichaam in de 2D-barcode buizen en het volgen van afgifte reagens sterk verbetert inventaris van antilichamen en de kwaliteitscontrole van onze werkwijze, respectievelijk.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
References
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
