조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em> Cre 호텔-LOX</em> 마우스 모델

사용 된 모든 재료에 대한 정보는 표 1에 제시되어있다. 모든 동물 실험은 영국 홈 오피스 프로젝트 라이센스의 권한으로 수행되었다. 1. CatnB 삭제는 AH-CRE와 VIL-Cre 호텔-ER (T2) 시스템을 사용하여 아 – CRE + CatnB + / +, AH-CRE + CatnB flox / flox, VIL-Cre 호텔-ER T2 CatnB + / +와 VIL-Cre 호텔-ER T2 CatnB flox 14 주 이전 동료 – (10)를 생성하기 위해 마우스 균주를 건너 / flox. β-β-gal을 얼룩을 통해 재결합의 시각적 분석을 위해, 동료는 Rosa26R-의 lacZ 기자 (17)를 포함해야합니다. 유전자 변형 유도 제제의 사용 유무를 제어한다 동료는 필요 코호트의 크기는 전력 분석을 이용하여 추정되어야한다. β 준비 AH-CRE의 유전자를 유도하기 위해; 또는 10 ㎎ / ㎖의 작업 솔루션을 제공하기 위해 옥수수 기름에 (TAM) 타목시펜 VIL-Cre 호텔 – 응급실 T2 형질 전환 유전자에 대한 -Naphthoflavone (BNF). 참고 : 에이전트는 적절한 개인 보호구를 사용하여 흄 후드에서 무게해야합니다. 수조에 BNF 99.9 ° C 또는 TAM 80 ° C 중 하나에 주황색 병에 열 솔루션 (BNF 민감한 빛). BNF 100 ℃로 설정된 가열 교반기로 전송하거나 TAM 80 ° C, 10 분간 교반 하였다. 용해 될 때까지 BNF가 1.3-1.4를 반복은 (> 1 시간이 걸릴 수 있습니다.) 작은 호박색 병 (~ 5 ㎖)로 분취 한 다음 -20 ℃에서 동결. 병 3 동결 / 해동 사이클 후 폐기해야합니다. 앞서 해동 약품을 사용하고 솔루션에서 떨어진 경우, 적절한 온도로 재가열합니다. 주입하기 전에 <37 ° C로 냉각시킵니다. 25g의 마우스 approp 0.2ml를 수신, 예를 들어 80 ㎎ / ㎏의 용량으로 마우스에 복강 내 (IP)에 삽입riate 유도 에이전트. AH-CRE의 경우 4 일 동안 하루에 한 주사를 제공 VIL-Cre 호텔 – 응급실 (T2)에 대한 24 시간 동안 세 주사를 제공합니다. 리포터 시각화 및 면역에 대한 소장 2. 해부 (IHC) 윤리적 승인에 따라 이전에 마취없이 경추 탈구를 사용하여 마우스를 안락사. 부정사 위치에 마우스를 놓고 70 %의 EtOH를 사용하여 모피 젖은, 가위를 사용하여 중간 선을 따라 길이 방향으로 내 복강을 엽니 다. 집게로 위장을 안전하고 식도의 연결을 단절. 부드럽게 위장 당겨 부록에 소장을 제거합니다. 부드럽게 부록 당겨 항문에 대장을 제거합니다. 창자가 고립되고 나면 위장과 부록을 제거합니다. 무딘 종단 피펫 팁과 주사기를 사용하여 1X PBS로 세척 장. 참고 : 각 장 내가해야mmediately 아래에서 설명하는 다운 스트림 응용 프로그램 중 하나에 대한 처리. 소장 3. 포르말린 고정 중간 및 원위부 3 동일한 크기 섹션과 라벨 근위로 플러시 소장을 잘라. 1cm 조각으로 각 섹션을 잘라. 외과 테이프 2cm X 2cm의 작은 조각을 가져 가라. 피라미드 형성에 수술 테이프의 중간에 세 1 다섯 형상 조각을 놓습니다. 닫기과 "로그 파일"효과를주고, 길이 방향으로 조각 주위에 테이프를 밀봉. 적어도 10 배, 조직 부피 정착액의 체적을 중성 완충 포르말린 고정액을 과량 함유 평평한 바닥 조직을 용기에 놓는다. , 고정 용 튜브 내에서 조직을 초과하는 금액을 두지 마십시오 여러 개의 컨테이너로 분할 : 주. 이전에 포함하고 절편에 24 시간 – 적어도 18 4 ° C에서 개최 샘플. 핵 β-catenin이 손실을 방지하기 위해 24 시간 이상 해결되지 않습니다.적어도 10 배 조직 부피, 70 %의 EtOH를 함유하는 과량의 평평한 바닥 컨테이너 정착 후의 전사 조직. 소장 4. Methacarn 고정 300 ml의 메탄올, 150 ml의 클로로포름 75 ㎖의 빙초산 조합 methacarn 정착액을 준비하기 전에 해부 (4 : 2 : 1). 근위 중간 및 원위부 3 동일한 크기의 섹션으로 플러시 소장을 잘라. 종이 필터 (15cm의 X15의 CM) 및 springbow 가위 'en 얼굴'을 열어를 사용하여 조각에 나란히 소장 측의 각 부분을 놓습니다. 실온에서 24 시간 – 3 methacarn를 포함하는 유리 접시에 소장 및 필터 종이를 놓습니다. 고정 후 집게를 사용하여 소장 섹션의 끝을 선택합니다. "스위스 롤"을 형성하고 약간 집게를 열고 그것을 통해 25 G 바늘을 넣어 롤을 고정 집게 주위에 장을 바람. 라를 포함하는 평면 바닥 용기에 조직을 배치중성 완충 포르말린 고정액의 RGE 초과, 처리를 진행하기 전에 적어도 1 시간 동안 조직과 저장소의 볼륨에 정착 적어도 10 배 볼륨. 5. 전체 마운트 LacZ를 시각화 (엘 Marjou 등에서 수정. 18) 10에서 미네랄 오일 용융 ralwax을 결합하여 왁스 판을 준비 : 1. 15cm 페트리 접시에 붓고 냉각 둡니다. 표 1에 따라 X-여자 정착액을 준비하고 얼음에 저장합니다. 전체 대장을 제거하고 25 ml의 얼음처럼 차가운 X-여자 정착액로 세척하여 제 2 절 수정 소장에 따라, 얼음처럼 차가운 1X PBS로 통해 세척합니다. 5 동일한 섹션 (플레이트 당 5 최대) – 가위를 사용하면 3로 장을 잘라. 왁스 판에 각 섹션을 놓고 부분이 약간 장간막 라인 맨으로 늘어 각각의 끝을 아래로 핀; 초과 장간막 트림. springbow 가위를 사용하여 길이 방향으로 창자를 잘라 길을 따라 핀.(60); 섹션을 커버하고 4 ℃에서 최소 1 시간 동안 떠나 X-여자 정착액와 함께 접시 홍수. 25 ML의 피펫을 사용하여 X-여자 정착액을 제거하고 1X PBS의 30 ㎖로 한 번 씻는다. 이상적으로 락 플랫폼에서 실온에서 60 분, – 30 DTT의 demucifying 용액 30 mL를 커버 섹션. 25 ML의 피펫을 사용하여 demucifiying 솔루션을 제거하고 1X PBS의 30 mL로 판을 홍수. 파스퇴르 피펫 사용하여 점액을 제거하는 판에 1X PBS로 장 섹션을 씻는다. X-여자 얼룩의 30 mL를 25 mL를 피펫과 홍수로 1X PBS를 제거합니다. 락 플랫폼에서 교반과 함께 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 품어. 배경색이 백색 인 경우 여전히 섹션, 청색 / 녹색 얼룩을 개발했는지 밤새 배양 검사 다음, 신선한 염색 액을 첨가하고, 염색이 발전까지 모니터 할 수있다. 참고 : 섹션이 다음 염색하면 더 염색을 시도 할 수 없습니다. X-여자의 얼룩 제거1X PBS의 30 ㎖로 25 ML의 피펫과 홍수 플레이트를 사용하여 부드러운 교반과 함께 3 분 동안 둡니다. 핀을 제거하고, 포셉, 소장 섹션의 마지막을 선택합니다. , "스위스 롤"을 형성 약간 집게를 열고 그것을 통해 25 G 바늘을 넣어 롤을 고정 집게 주위에 장을 바람. 적어도 10 배 조직 부피 정착액의 체적을 중성 완충 포르말린 고정액을 과량 함유 넓은 입이 큰 용기에 평평한 바닥 조직을 놓는다. 이전에 포함하고 절편에 최소 24 시간 동안 4 ° C에서 장소 샘플. 소장에서 납골당 6. 추출 섹션 2. 깨끗한 해부 표면에 장 당과 집게와 가위에 장착 된 모든 지방 / 장간막을 제거 사용하는 등, 소장의 첫 번째 20cm를 분리합니다. springbow 가위는 길이 방향으로 장을 열 사용. F를 커버 현미경 슬라이드를 사용하여irmly 융모와 점액을 제거하는 창자 루멘을 긁어. 가위를 사용하여 페니실린 (100 U / mL) 및 스트렙토 마이신 (100 U / ㎖)으로 보충 ~ 5mm 조각으로 절단 부위를 25 ㎖ 1X HBSS로 50 ㎖ 튜브에 옮긴다. 실온에서 10 분 동안 품어. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플을 전달하여 항생제를 포함하는 용지를 제거합니다. 10 ㎖의 1X HBSS를 포함하는 새로운 50 ML 튜브에 장 섹션을 놓고 뚜껑을 교체합니다. 조심스럽게 두 번 반전 및 70 μm의 셀 스트레이너를 통과하여 1X HBSS를 제거합니다. 또한 6.4 및 6.5 세 번 반복하여 장 조각을 씻고 마지막 부분이 상대적으로 깨끗한 지 확인합니다. EDTA (8 mM)을 / 1X HBSS 10 ㎖를 함유하는 신선한 50 ㎖ 튜브에 옮기고 조직을 5 분 동안 실온에서 떠난다. 적극적으로 (20 – 30 배) 흔들거나 소용돌이, EDTA (8 밀리미터) / 1X HBSS를 포함하는 새로운 50 ML 튜브에 70 μm의 셀 스트레이너 및 전송 조직 조각을 통해 전달합니다. 노트:폐기 또는 융모 상피의 분석이 필요한 경우 유지 될 수있는 방식을 통해 흐름. 30 분 동안 얼음에 조직 조각을 품어 적극적으로 샘플 흔들 (20 – 30 배) 또는 소용돌이를. 70μm 셀 스트레이너를 통해 샘플을 전달하고이 지하실을 포함로 흐름을 통해 유지. 1X HBSS 10 ㎖를 함유하는 신선한 50 ㎖ 튜브에 조직 조각을 전송. 적극적으로 (20 – 30 배) 흔들거나 소용돌이를, 70 μm의 셀 스트레이너를 통과 통해 흐름을 유지합니다. 장 조각에서 지하실의 최대 복구를 보장하기 위해 한 번 더 반복한다. 5 분 동안 300 XG에 분획 원심 분리를 통한 유동을 결합한다. 상층 액을 붓고 지하실 펠렛을 유지합니다. 참고 : 펠렛 배양을 위해 즉시 사용 (해당하는 경우) 또는 이전에 표준 DNA / RNA / 단백질 추출 절차에 -80 ℃에서 저장 될 수있다. 7. 표준 면역 시각화 5 μ 컷폴리 -L- 라이신 (PLL)의 슬라이드 상 파라핀 조직 m 섹션. 참고 : B-카테닌 항체로 염색하는 표준 프로토콜은 아래와 같습니다, 다른 항체 매개 변수는 표 2에 제시되어있다. 신선한 자일 렌을 포함하는 슬라이드 화장실에 2 배 3 분 세척과 드 왁스. 신선한 포함 슬라이드 화장실을 통해 3 분 동안 슬라이드를 전달하여 재수 : 1X PBS로 100 %의 EtOH (2 배), 95 % EtOH로 70 % EtOH로 마지막을. 20 분 항원을 검색하는 구연산 완충액 (pH 6)과 열 99.9 ° C를 포함하는 슬라이드 욕조에 배치 슬라이드. 슬라이드를 냉각 한 후 5 분 동안 1xTBS / T를 포함하는 슬라이드 욕조에 3 배 5 분 세척 할 수 있습니다. 바로 PAP 펜으로 조직 주위에 그려, 마지막 세척에서 슬라이드를 제거하고 (증류수 H 2 O)에 상용 퍼 옥시 다제 블록 또는 1.5 % H 2 O 2 섹션 커버. 실온 (RT)에서 20 분 동안 배양 한 다음 5 분 동안 신선한 1X의 TBS / T를 포함하는 슬라이드 조에 3X 씻는다. 세척 후(NRS) 실온에서 30 분 기본 항체의 비특이적 소수성 결합을 차단하기 위해 / 1xTBS는 / T 5 % 정상 토끼 혈청에서, 피펫을 사용하여, 커버 섹션을 보내고. 5 % NRS 200 : 1로 희석 B-catenin이 차 항체의 파스퇴르 피펫 커버 섹션 NRS 블록을 제거합니다. 워시 / T 신선한 1xTBS를 포함하는 슬라이드 화장실에서 배 5 분 동안 슬라이드. 주 – 다른 항체를 희석 및 특이성에 대한 최적화가 필요합니다. 항체의 특이성을 보장하기 위해, 적절한 더 항체 및 이소 제어 얼룩이 수행 될 수 없습니다. 이소 제어는 호스트 종과 차 항체의 이소 타입에 매칭된다. 중 상용 HRP 검출 키트 또는 적절한 형광 표지 된 이차 항체 (표 2)와 시각화. 참고 : – 15 초 충분합니다 개발의 길이는 10 β-catenin이 경우, 각 항체 다릅니다. 항체 처음 EST에 대한 개발을 최적화하려면다음, 양성 대조군 슬라이드를 사용하여 양성 세포를 시각화하는데 필요한 시간의 길이는 모든 후속 슬라이드에 이것을 적용 ablish. 워시 신선한 TBS / T를 포함하는 슬라이드 화장실에서 배 5 분 동안 슬라이드. ~ 45 초 동안 슬라이드 목욕 포함 헤 마톡에 침지하여 슬라이드를 Counterstain과 (형광 이차 항체를 표지 사용하는 경우에는 필요하지 않음). 깨끗한 슬라이드 목욕에 슬라이드를 넣고 완전히 세척되지 않은 헤 마톡을 보장합니다 ~ 1 분 동안 수돗물을 실행 씻어. 알코올의 농도를 증가 함유 슬라이드 화장실 통과하여 슬라이드를 탈수; 1X 70 % EtOH 중 30 초, 95 % EtOH 중 1X 30 초, 100 % EtOH 중 2 × 30 초간 세척, 크실렌에 2 × 2 분. 마운트는 상용 설치 미디어를 사용하여 커버 슬립 아래 슬라이드. 참고 : 형광 표지 된 항체를 사용하는 경우 핵 레이블을 DAPI를 포함하는 미디어를 탑재합니다. 특정 Intestina 8. 조직 학적 확인L 상피 세포 장 세포 표 2에 설명 된 villin 항체 및 조건 섹션 7을 사용 섹션을 준비합니다. 엔테로 – 내분비 세포 (Grimelius는 18, 19 얼룩). 단계 7.1-7.2에 따라 섹션을 준비합니다. 세척은 3 분간의 초순수를 포함하는 슬라이드 욕에서 슬라이드. 예열은 용액 (표 1)을 함유하는 슬라이드 조에 슬라이드를 전송하고 3 시간 동안 60 ℃에서 배양한다. 3 분 동안 45 ℃에서 예열 된 감속기 갓 준비한 용액을 함유하는 욕 슬라이드 (표 2)에서의은 용액과 장소에서 슬라이드를 제거한다. 슬라이드를 제거하고 3 분 동안 신선한 초순수를 포함하는 슬라이드 욕에 배치했다. 팔로우 섹션 7에서 7.6-7.8 단계를 반복합니다. 잔 세포 (알 시안 블루 염색). 알 시안 (BL)을 포함하는 슬라이드 화장실에 .. 다음 단계 7.1-7.2로 전송 슬라이드를 섹션을 준비RT에서 5 분 동안 UE 산도 2.5. 5 분 – 3 실행 탭에서 피펫과 장소 슬라이드 욕조 알 시안 블루 얼룩을 제거합니다. 단계 7.6-7.8를 수행합니다. 참고 : 알 시안 블루 솔루션은 더 사용을 위해 유지 될 수있다. ISCS. ISCS 부 (9)에 따라 식별합니다. Paneth 세포. 표 2에서 설명하는 라이소자임 항체와 조건을 사용하여 7 항 다음 섹션을 준비합니다. 쥐의 소장 19-21으로 제자리 RNA를 검출 9. PLL 슬라이드에 포르말린 고정 소장 (섹션 3)에서 5 μm의 섹션을 놓습니다. Olfm4 식 (21)을 검출하기위한 선형화 된 디그 옥시 제닌 표지 된 RNA 프로브를 준비한다. 왁스 제거 및 부 7. 주 당 부분을 재수 :이 프로토콜은 RNA 프로브의 열화를 방지 할 RNAse가없는 환경에서 수행되어야한다. T 주위 그리기PAP 펜 문제는 시약을 최소화합니다. 30 분 동안 (증류수 H 2 O)에서 6 % H 2 O 2와 슬라이드 목욕 섹션을 품어. 3 분 동안 신선한 1X PBS로 슬라이드 욕조에 두 번 씻으십시오. 얼음 위에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 피펫, 덮개 부를 이용하여, 1X PBS 버리고. 3 분 동안 신선한 1X PBS로 슬라이드 욕조에 두 번 씻으십시오. 3 분 동안 신선한 1X PBS로 슬라이드 욕조에서 5 분간 세척에 대한 테 K 솔루션 피펫 커버 섹션을 사용. 실온에서 5 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 취재하여 피펫 후 수정 섹션을 사용. DEPC와 슬라이드 화장실에서 씻어 2 분 동안 H 2 0을 처리 하였다. 교반하면서 10 분 동안 아세트산 무수물 용액에 피펫 커버 부 사용. 1X 식염수 / 3 분 뒤에 신선한 1X PBS / 3 분으로 슬라이드 화장실에서 씻으십시오. 알코올의 농도를 증가 포함 된 화장실을 통해 슬라이드를 통과; 1X 30 초 70 %에서 EtOH로, 1X 30 초 95 %에서 EtOH로, 신선한 100 %의 2 배 30 초 세척 EtOH로,배 2 신선한 크실렌 분, 공기 건조하도록 허용합니다. 혼성화 버퍼 (100)를 3 분 동안 80 ℃로 가온하여 프로브를 변성 : Olfm4 프로브 1 희석. 각 섹션에 프로브의 100 μl를 적용하고 슬라이드의 탈수를 방지하기 위해 파라 필름 커버. 65 ℃에서 어둡고 습한 챔버에서 하룻밤 품어. 15 분 동안 65 ℃에서 5 × SSC와 슬라이드 화장실에서 씻으십시오. 65 ℃에서 30 분 동안 / 신선한 50 % 포름 아미드로 두 번 슬라이드 욕조에 5 × SSC / 1 % SDS를 섹션을 씻으십시오. 10 분, 65 ℃에서 제 실온에서 두 번째 신선한 PBT에서 슬라이드 욕조에 두 번 절을 씻으십시오. PBT는 37 ℃에서 45 분 동안 25 μg의의 RNAse를 포함와 피펫 커버 섹션을 사용. 실온에서 5 분간 PBT에서 슬라이드 목욕 섹션을 씻으십시오. 65 ℃에서 30 분 동안 / 신선한 50 % 포름 아미드로 두 번 슬라이드 욕조에 5 × SSC를 섹션을 씻으십시오. 차단하려면, 어두운, MOI에서 PBT 및 저장 10 % 양의 혈청 피펫을 사용하여 커버 섹션3 시간 – 2 RT 세인트 실. 5 ㎎ / ㎖ 마우스 장 분말을 함유 PBT 10 %의 양 혈청 500 : 1 항 디곡 시게 닌 알칼리 포스파타제에 접합 된 항체를 희석하여 항체를 준비한다. 락 플랫폼에서 어둠 속에서 4 ° C에서 3 시간 동안 품어. 과량 장내 분말을 제거하고 상청액을 PBT에 1 %의 양의 3 배 양의 혈청을 추가 스핀 다운. 피펫 슬라이드에서 블록을 제거하고 각 섹션에 항체 용액 100 μl를 추가, 파라 필름으로 커버하고 4 ° C에서 하룻밤 어두운, 습기 챔버에 품어. 5 분 동안 신선한 PBT와 슬라이드 욕조에 3 ×를 섹션을 씻으십시오. 섹션 5 분 동안 신선한 NTMT 버퍼와 슬라이드 욕조에 3 × 씻어 ​​차단합니다. 충분히 강한 색상이 개발 될 때까지 72 시간 – 피펫 BM 보라색 각 부분을 커버하고 24 실온에서 어둠 속에서 부화하여 시각화합니다. PBT 번 슬라이드 목욕 섹션을 세척하고 1 분 동안 에오신에 침지 Counterstain과. 레모5 분 – 3 흐르는 물 슬라이드 목욕 세척 섹션으로 초과 에오신을했습니다. 크실렌에 슬라이드를 담그고 공기 건조하도록 허용합니다. 상업 미디어를 사용하여 커버 슬립 아래에 마운트합니다. 장내 상피 10. 조직 학적 특성 PLL 슬라이드에 고정 된 조직 (섹션 3 & 4)에서 5 μm의 섹션을 놓습니다. ≥25 임의 전체 (또는 ≥50 반) 다음 각 매개 변수에 대한 각 집단의 ≥4 마우스에서 지하실을 분석합니다. 참고 : 일관성 (만 기단부를 사용) 각 장의 동일한 위치에서 지하실을 분석 유지합니다. 표준 H & E 염색 부분에서 세포 매개 변수 (달리 명시되지 않는 한) : 크립트 수, 높이, 세포 사멸 및 유사 분열. 크립트 번호. 수동 기저층과 접촉 소낭의 수를 카운트하는 저전력 배율 (예를 들면 4 배 또는 10 배)를 사용한다. 카운트 ≥10 가로 근위 대장 분파를적어도 4 생쥐 이온. 크립트 높이입니다. 수동 토굴 / 융모 축 (도 3b)에 토굴의 바닥으로부터 세포의 수를 계산하기 위해 고전력 배율 (예를 들면 20 배 또는 40 배)를 사용한다. 아폽토시스 22, 23. 방법 1 : 수동으로 각 토굴에서 사멸 세포의 수를 계산하는 높은 전력 배율 (. 예를 들어 20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 사멸 세포는 세포 수축, 염색질 응축, 세포 내 소포 및 세포 자멸 소체 (도 3a)의 형성에 의해 식별 될 수있다. 방법 2 : IHC 염색을 수행 대 (7) 카스파 제 -3 수동에 세포를 정량화하기 위해 각 토굴에서 양성 세포의 수를 계산 고전력 배율 (예 : 20 배 또는 40 배한다.)를 사용하여 표 2 기재된 조건 사용.을 세포 사멸의 실행 단계. 유사 분열. <ol> 수동으로 각각의 토굴에서 유사 분열 세포의 수를 계산하는 높은 전력 배율 (예를 들어 20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 유사 분열 세포는 DNA 물질을 응축하고 일반적으로 대칭 및 웰 (도 3b)이 형성된다 포함. 분아 증식. 기 – 67 표 2에 기재된 조건을 사용한 IHC (7) 염색을 수행한다. 수동 토굴 증식 세포의 비율을 정량하는 양성 세포를 셀.