Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

La migración celular es altamente coordinada y vital para muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo de tejidos, la reparación y la regeneración, así como procesos patológicos tales como la metástasis del cáncer y la arteriosclerosis ^1. Una comprensión de la migración celular es particularmente relevante para las nuevas terapias utilizadas para reparar los tejidos dañados y tratar condiciones patológicas, incluidas las tecnologías de trasplante de células y tejido artificial injerto ^2. Dado el interés actual en el papel de las células estromales mesenquimales (MSC) en la mediación de la reparación de tejidos ^3, la cuantificación de la capacidad migratoria de estas células utilizando un ensayo que es rigurosamente cuantificables, adaptable y rentable es de interés. Es importante destacar que dicho ensayo deberá ser lo suficientemente sensible para detectar cambios relativamente sutiles en la capacidad migratoria celular después del daño. Los métodos actuales para cuantificar la migración de células, incluyendo los ensayos de cero, los ensayos de migración trans-pocillos (Boyden chámbar), matrices microcolumnas, y ensayos de la zona de exclusión de células poseen una serie de limitaciones en la reproducibilidad, personalización, cuantificación, y la rentabilidad ^1,4,5. El ensayo cero optimizado descrito aquí demuestra resultados robustos, capacidades de análisis cuantificables y basados ​​en imágenes, la rentabilidad y la capacidad de adaptación a otras aplicaciones.

Los ensayos de cero se han utilizado en múltiples capacidades para evaluar la migración y la proliferación celular en diferentes condiciones experimentales ^5. El ensayo implica la siembra de las células designadas, el crecimiento de ellos para completar o cerca de confluencia, y arañar la monocapa resultante con una aguja estéril o punta de la pipeta ^6. Análisis es más comúnmente lleva a cabo comparando el ancho de la cero a través de múltiples puntos de tiempo en lugares seleccionados al azar ^7-9. A pesar de su uso prominente, el ensayo cero es confundida por problemas con la reproducibilidad y la cuantificación. La variabilidad engeneración del cero no sólo altera el microambiente de las células, pero también puede impedir la migración de células al dañar la superficie de la placa y la matriz extracelular subyacente ^5. Los ensayos se llevan a cabo con frecuencia más de 7 a 12 horas, sin embargo, para las líneas celulares que muestran la migración más lenta y tiempos de ensayo más largos, la proliferación se convierte en una variable de confusión ^7,10. Por último, las células senescentes generados por el proceso de rascado pueden liberar factores que interfieren con la señalización extracelular requerida para cerrar la brecha en la monocapa ^1. Optimización del ensayo de cero requiere la creación de un vacío constante que no interfiera con las propiedades de superficie, minimizando ensayo de duración de tiempo, y la prevención de la muerte celular no deseada durante la manipulación. El ensayo basado tapón es una optimización de un ensayo de zona de exclusión celular. Este ensayo utiliza un tapón colocado en el centro del pozo que excluye el crecimiento celular, pero permite que las células se sembraron alrededor de la zona de exclusión central.Para evaluar la migración, se quita el tapón, y la zona de exclusión resultante proporciona una superficie para que se produzca la migración. Sin embargo, este ensayo es difícil personalizar o adaptar ¹⁰ y para algunas aplicaciones, esta técnica también puede tener un costo prohibitivo.

En contraste con los ensayos de cero y sus derivados, los ensayos de migración trans-bien (o ensayos de cámara de Boyden) evaluar la migración mediante la cuantificación del número de células que se mueven de una cámara, a través de una membrana de filtro microporoso, en una cámara que contiene agentes quimiotácticos ^{8,11, 12.} Esta técnica tiene una utilidad limitada para las células adherentes como MSCs porque después de la migración a través de la membrana porosa, las células se adhieren a un lado membrana expuesta a los agentes quimiotácticos, y pueden ser difíciles de cuantificar con precisión. Mientras que el ensayo es capaz de examinar algunos patrones de migración en tres dimensiones, los tipos de células restringidas de las que es capaz de cuantificar con precisión el límite de migración celular su utilidad ¹⁰. Otra alternativa a los ensayos de cero utiliza una matriz de micro-pilar, que mide la motilidad celular a través de un espacio tridimensional utilizando la capacidad de las células para deformar y migrar en la matriz como un sustituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre un molde preciso y tratados con ozono y fibronectina produce un microambiente homogénea y no degradable. Espaciamiento Micro-pilar también se puede variar como sea necesario para medir la capacidad de las células para entrar en la matriz ^4. El molde se crea a través de grabado iónico reactivo profundo de obleas de silicio para crear una versión negativa de la matriz de alta relación de aspecto ^13. Mientras que el ensayo se refuerza por su personalización, capacidad de modelar la migración tridimensional, y el análisis a través de la visualización directa de células que migran, dificultad en la creación de matrices de micro-pilar económicamente impide su uso generalizado.

El ensayo cero optimizado descrito en este protocolo proporciona un eficiente, cosmétodo t-efectiva para producir rasguños consistentes que pueden ser analizados utilizando el software de libre acceso. En lugar de medidas de ancho simples hechas a través del cero antes y después de la migración celular, el software permite al usuario determinar las áreas totales de arañazos antes y después de la migración. Este avance limita el problema de tratar de determinar dónde está el cero las medidas de ancho se deben tomar, y si el ancho de la cero es uniforme a lo largo de su longitud. Además, la optimización cuidadosa del número de células, la confluencia celular y el tipo y grado de daño causado a las células se discute con el fin de optimizar aún más el ensayo.