Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

La migrazione cellulare è altamente coordinato e vitale in molti processi fisiologici quali lo sviluppo dei tessuti, la riparazione e la rigenerazione, nonché processi patologici quali metastasi del cancro e l'arteriosclerosi ^1. Una comprensione della migrazione delle cellule è particolarmente rilevante per terapie emergenti utilizzati per riparare i tessuti danneggiati e il trattamento di condizioni patologiche, comprese le tecnologie di trapianto di cellule e tessuti artificiali di innesto ^2. Dato l'attuale interesse per il ruolo delle cellule stromali mesenchimali (MSC) nella mediazione riparazione dei tessuti ^3, quantificare la capacità migratoria di queste cellule utilizzando un metodo che è rigorosamente quantificabile, adattabile, e conveniente è di interesse. È importante sottolineare che un tale test deve essere sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti relativamente sottili cellulare capacità migratoria dopo un danno. Gli attuali metodi per quantificare la migrazione delle cellule, tra cui saggi e vinci, trans pozzetti test di migrazione (Boyden chambre), array micropillar, e saggi zona di esclusione cellulare in possesso di una serie di limitazioni nella riproducibilità, personalizzazione, la quantificazione, e costo-efficacia ^1,4,5. Il test zero ottimizzata qui descritto dimostra esiti robuste capacità di analisi quantificabili e basati su immagini, costo-efficacia, e l'adattabilità ad altre applicazioni.

Scratch saggi sono stati utilizzati in molteplici capacità di valutare la migrazione cellulare e la proliferazione in diverse condizioni sperimentali ^5. Il test prevede la semina le cellule designate, crescendo loro di completare o nei pressi di confluenza, e graffiare il monostrato risultante con un ago sterile o pipetta punta ^6. Analisi è più comunemente effettuata confrontando la larghezza del graffio su più punti di tempo in luoghi selezionati casualmente ^7-9. Nonostante il suo uso prominente, il dosaggio zero è confuso da problemi con la riproducibilità e la quantificazione. Variabilità ingenerazione del graffio non solo modificando il microambiente delle cellule, ma può anche impedire la migrazione delle cellule danneggiando la superficie sottostante piastra e extracellulare matrice ^5. I saggi sono spesso condotti per 7-12 ore, ma per linee cellulari che mostrano una migrazione più lenta e tempi di analisi più lunghi, la proliferazione diventa una variabile confondente ^7,10. Infine, le cellule senescenti generati dal processo di graffiare può rilasciare fattori che interferiscono con la segnalazione extracellulare necessaria per colmare il divario in monostrato ^1. Ottimizzazione dosaggio zero richiede la creazione di un vuoto costante che non interferisce con le proprietà superficiali, minimizzando dosaggio lunghezza di tempo, e prevenire la morte delle cellule indesiderate durante la manipolazione. Il saggio basato tappo è una ottimizzazione di un saggio zona di esclusione cellule. Questo saggio utilizza un tappo posto al centro del pozzo che esclude la crescita cellulare, ma permette alle cellule di essere placcato intorno alla zona di esclusione centrale.Per valutare la migrazione, il tappo viene rimosso, e la zona di esclusione risultante fornisce una superficie per la migrazione a verificarsi. Tuttavia, questo test è difficile da personalizzare o adattare ¹⁰ e per alcune applicazioni, questa tecnica può anche essere costo proibitivo.

In contrasto con saggi graffiatura e loro derivati, saggi di migrazione trans-well (o camera di Boyden saggi) valutano la migrazione quantificando il numero di celle che si muovono da una camera, attraverso una membrana microporosa filtro, in una camera contenente agenti chemiotattici ^{8,11, 12.} Questa tecnica ha limitato l'utilità di cellule aderenti come MSC perché dopo la migrazione attraverso la membrana porosa, le cellule aderiscono al lato della membrana esposta agli agenti chemiotattici, e può essere difficile da quantificare con precisione. Mentre il test è in grado di esaminare alcuni modelli di migrazione tridimensionali, i tipi di cellule ristrette per il quale è in grado di quantificare accuratamente limite migrazione cellulare sua utilità ¹⁰. Un'altra alternativa per saggi scratch utilizza una matrice di micro-pilastro, che misura la motilità cellulare attraverso uno spazio tridimensionale utilizzando la capacità delle cellule di deformarsi e migrare nella matrice come un surrogato. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeri curati su uno stampo preciso e trattati con ozono e fibronectina produce un microambiente omogeneo e non degradabile. Spaziatura Micro-pilastro può anche essere variata come necessario per misurare la capacità delle cellule di entrare nella matrice ^4. Lo stampo viene creato attraverso profonda ioni reattivi di wafer di silicio per creare una versione negativa di alta con formato matrice ^13. Mentre l'analisi è rafforzata dalla sua personalizzazione, capacità di modellare la migrazione tridimensionale, e l'analisi attraverso la visualizzazione diretta delle cellule migranti, difficoltà nella creazione di array di micro-pilastro ostacola economicamente la sua diffusione.

Il dosaggio zero ottimizzata descritto in questo protocollo offre un efficiente, cosMetodo t-efficace per produrre graffi coerenti che possono essere analizzati utilizzando il software liberamente disponibile. Invece di semplici misure di larghezza effettuate attraverso il graffio prima e dopo la migrazione delle cellule, il software permette all'utente di determinare le aree totali scratch prima e dopo la migrazione. Tale avanzamento limita il problema di cercare di determinare dove il graffio opportuno prendere le misure di larghezza, e se la larghezza del graffio è uniforme lungo la sua lunghezza. Inoltre, attenta ottimizzazione di numero di cellule, cellule confluenza e il tipo e grado di danno inflitto sulle cellule è discusso per ottimizzare ulteriormente il dosaggio.