JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
발생학

Генерация агрегатов эмбриональных стволовых клеток мыши, которые показывают нарушение симметрии, поляризация и возникающим коллективной Поведение<em> In Vitro</em

Published: November 24, 2015
doi:
10.3791/53252
, , , ,
1Department of Genetics,University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

Summary

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

Abstract

Мы разработали протокол улучшения текущего эмбриоида тела (EB) культуру, которая позволяет изучение самоорганизации, нарушение симметрии, осевой удлинение и судьба клеток спецификации, используя агрегаты мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs) в суспензионной культуре. Небольшое число mESCs агрегируются в базальной среде в течение 48 ч в 96-луночных планшетах без тканевых культур, обработанных U-дном, после чего их компетенции отвечать на экспериментальных сигналов. После обработки, эти агрегаты начинают показывать признаки экспрессии гена поляризованного и постепенно изменять их морфологию от сферической массы клеток к удлиненному, хорошо организованной структуре, в отсутствие внешних сигналов асимметрии. Эти структуры способны не только отображать маркеры трех зародышевых листков, но и активно отображения гаструляции, как движения, о чем свидетельствует направленного смещение отдельных клеток из совокупности, которая в решающей происходит в одном регионе удлиненной конструкции. Это protocол дается подробное способ воспроизводимого формирования этих агрегатов, их стимуляции сигналов, таких как Wnt / β-катенин активации и ингибировании BMP и их анализа с помощью одного момента времени или покадровой флуоресцентной микроскопии. Кроме того, мы опишем изменения в текущих процедур окрашивания эмбрион весь монтажа мыши для иммуноцитохимического анализа специфических маркеров в течение установленного агрегатов. Изменения в морфологии, экспрессии генов и длиной агрегатов может быть количественно измерено, предоставление информации о том, как сигналы могут изменить осевые судьбы. Предполагается, что эта система может быть применена и к изучению ранних событий развития, таких как развитие осевого и организации, и в более широком смысле, процессы самоорганизации и клеточной принятия решений. Он также может обеспечить подходящую нишу для генерации типов клеток, присутствующих в эмбрионе, не достижимые при обычной культуры прикрепленных такие как спинного мозга и мотонейронов.

Introduction

Изучение и понимание клеточной судьбы решений в раннем развитии млекопитающих могут воспользоваться культур эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), клоновых популяциях, полученных от бластоцисты, которые имеют возможность самостоятельно обновить и дифференцироваться во все типы клеток организма есть., они плюрипотентные 1,2. В то время как эти культуры были и продолжают быть полезными для понимания молекулярных основ клеточной судьбы решений, они не в состоянии воспроизвести некоторые из пространственных механизмов и глобальных поведения, которые создаются в эмбрионах во время гаструляции. В эмбриона, процесс переходит гаструляцией одну эпителиальный слой в трех различных зародышевых листков и наделяет эмбрион с открытой организации переднезаднем 3-5. Попытки повторять эти события Экс Vivo были основаны на генерации трехмерных агрегатов ЭСК, называемая эмбриоидных органов (ЭТ), и подвергая их тО условия дифференциации 6,7. Эти агрегаты могут быть уговорен дифференцироваться в различные типы клеток, некоторые из которых либо не могут быть получены или индуцированных с низкой эффективностью в прикрепленной культуре или не может быть произведены на всех;. Например, кровь и 8 примордиальных зародышевых клеток 9. Ограничение в использовании ЭТ однако, является то, что они не в состоянии отобразить морфогенетическое поведение, распределение зародышей слоя или осевой организации, которые являются основными характеристиками развивающегося эмбриона, в результате пространственного дезорганизации 6,10. В одном докладе, лечение ЭТ с Wnt приводит к слабому поляризации в экспрессии генов в некоторых агрегатов, но не ясно, морфогенез не наблюдается 7. В более поздних отчетов, ЭТ, которые культивировали в течение длительных периодов времени разработки передние структуры, такие как сетчатки, мозга и внутреннего уха сенсорных клеток, которые имитируют их аналоги эмбриональных но развиваться без контексте осевом organizatионная 11-13.

В докладе Marikawa др. 14, время работы с агрегатами мыши Р19 эмбриона карциномы (ЭК) клеток, сформированных способом висячей капле, сообщает возникновение вытянутых структур мезодермального происхождения напоминающей удлинений, которые наблюдаются с exogastrulae в амфибии и эмбрионы морских ежей и Келлер экспланты 15-18. Как это не было отмечено с мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), мы попытались воспроизвести поведение, наблюдаемое с P19 клетки EC использованием агрегатов mESCs 19, и мы сообщить условия культивирования, которые приводят к их симметрии и осевой удлинение. Важным отличием от работы с P19 клеток является то, что протокол агрегации, описанный здесь выполняется в 96-луночный планшет, аналогичной той, что описана Eiraku и др. 20, вместо того, чтобы висеть капель. Это изменение привело к увеличению эффективности с точки зрения совокупного восстановления, и в обоихвнутри и между экспериментальной воспроизводимости. Важно отметить, что поддержание агрегатов в отдельных скважинах гарантирует, что слияние между агрегатами (общий, когда объединение агрегатов из висячей капли) не происходит. Кроме того, ключевой особенностью протокола является 24 ч воздействия ингибитора GSK3 CHI99021 (Chi), мощного активатора сигнализации Wnt / β-катенин, после агрегации.

Метод, описанный здесь служит основой для понимания процессов самоорганизации, осевой организации и зародышей спецификации слоя в культуре, что позволяет выводы быть сделаны в отношении осевого развития в естественных условиях 19,21. По этим причинам метод имеет потенциал, чтобы разрешить детальную механистический анализ процессов, которые могут быть трудно учиться в зародыше. Кроме того, потенциальное применение в генерации тканей и органов, которые не легко доступны в прикрепленной культуре в связи с отсутствием структурированного сотовой нише, таких какспинного мозга предшественников 21 и мотонейроны. Трехмерная совокупность культура предлагает физическую структуру и сигнализации среды, которые не могут быть достижимы с помощью традиционных средств, что приводит к новому подходу для вывода эмбриональных линий в пространственно организованной манере.

Protocol

1. Условия культивирования До агрегации Поддержание mESCs в ESLIF среды (табл конкретных материалов & оборудование для разработки) на покрытые желатином 25 см 2 ткани культуры обработке колб в увлажненном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2 21-25. Рост клеток не менее двух проходов прикреплять оттаивание перед использованием в этом протоколе; Клетки при более низких проходов, как правило, более успешны в создании воспроизводимыми характеристиками во всем экспериментальным повторов (т.е.., не более 15 пассажей в культуре), однако небольшое изменение между различными ES клеточные линии можно ожидать (таблица 2 для испытанных клеточных линий ). Рост клеток в 40-60% слияния. Не используйте слишком сливной клетки для агрегации. 2. Генерация агрегатов Предварительно теплой PBS (+ Са 2+, Mg 2+ +), ESLIF, N2B27 26,27 </suр> и трипсин-ЭДТА в С на водяной бане 37 °. Аспирируйте культуры из культуры тканей колбы (шаг 1.3). Промойте колбу осторожно 5 мл PBS, в два раза. Аспирируйте PBS и добавить 1 до 2 мл подогретого трипсин-ЭДТА (0,25%) диссоциацию клеток. Колбу помещают в инкубатор на <5 мин или до клетки полностью отделен от поверхности колбы. Внесите вверх и вниз с 1 мл пипетки, чтобы генерировать один-клеточной суспензии для точного подсчета и формирования единого совокупного размера. Нейтрализовать трипсина с 5-10 мл ESLIF; Запивать поверхность роста, чтобы максимизировать восстановление клеток и передачи в 50 мл центрифужную пробирку. Снимите 1 мл аликвоты из центрифужную пробирку и подсчет клеток с гемоцитометра. Определить объем суспензии, необходимую для получения 10 клеток / мкл (в целом 96-луночный планшет требует 5×10 4 клеток в 5 мл суспензии). Граф клеток точно, как большие Девьяионов из указанного количества клеток может негативно повлиять на реакцию агрегатов на раздражители. Добавить 5×10 4 клеток на 5 мл подогретого PBS в свежем 50 мл центрифужную пробирку и спина в ~ 170 мкг в течение 5 мин. Тщательно аспирата PBS и добавить 5 мл подогретого PBS мягко; Не беспокоить гранул в нижней части трубы. Центрифуга при температуре ~ 170 мкг в течение 5 мин. Тщательно аспирации PBS во второй раз. Удалить столько PBS, как это возможно, не нарушая гранул как PBS переносом может отрицательно повлиять на агрегацию. Ресуспендируют гранул в первую очередь в 1 мл теплого N2B27 с P1000 пипетки, чтобы генерировать однородную клеточной суспензии, с последующим дальнейшим добавлением N2B27 требуемого объема (например, добавить 4 мл на 5×10 4 клеток / 5 мл суспензии). Передача клеточной суспензии в стерильную резервуара и пипеткой 40 мкл капли в нижней части каждой лунки не-культуре тканей обработанной "U 'дном 96-WELL пластины с использованием многоканальной пипетки. Накройте 96-луночный планшет с соответствующим крышкой и подтвердить наличие клеток с перевернутой настольного микроскопа (Фиг.1В). Примечание: Очень важно, чтобы эти плиты используются для ограничения возможности клеток, прилипших. Не наносите на нижнюю часть 96-луночного планшета с желатином, фибронектин или любой другой покрытием, что способствует адгезии клеток. Инкубируйте клетки в течение 48 ч во влажном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2 в течение агрегации. 3. Применение стимулов и изменение Medium После 48 ч инкубационного периода, наблюдать появление mESCs в каждую лунку 96-луночного планшета для подтверждения успешного агрегации (рис 1E). Примечание: Агрегаты появится сферическую природы и приблизительно 150-200 мкм в диаметре. Обратитесь к разделу Устранение неполадок, если возникают проблемы (таблица 1). 0; Добавить 150 мкл свежей вторичной среды (3 мкм Chi99021 (Chi) в N2B27 19; запас, подготовленный в 10 мМ в ДМСО) в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Пипетка с достаточной силой, чтобы сместить любые агрегаты, которые могут быть созданные придерживаться дно лунок. Инкубируйте агрегатов в вторичной среды в течение 24 ч во влажном инкубаторе при 37 ° С и 5% CO 2 (фиг.1А). Примечание: Воспроизводимые удлиненные и поляризованные агрегаты образуются с помощью этого вторичной среды. Другие композиции вторичной среды могут также быть использованы в зависимости от экспериментальных условий, необходимых и примеры приведены на рисунке 3. Для последующих изменений средних, использовать многоканальную пипетку держать под углом (примерно 30 °), чтобы мягко удалить 150 мкл вторичной среды со стороны каждой лунки. Затем, пипетки 150 мкл свежей N2B27 в каждую лунку с достаточной силой, чтобы выбить любые агрегаты, которые могут иметь началоред придерживаться нижней части скважины. Повторите пункт 3. 3 каждый 24 ч до времени, конечно-это полный (типичный длина совокупного опыта культуры 120 ч). Примечание: Убедитесь, агрегаты свободно перемещаются следующей среде изменения, чтобы обеспечить воспроизводимость и последовательность внутри и между каждой 96-луночного планшета. Среда должна быть изменена ежедневно после периода агрегации. 4. Подготовка агрегатов для Иммуноокрашивание и анализа конфокальной микроскопией Фиксация и первичное антитело Инкубационный Примечание: Протокол, описанный А. К. Hadjantonakis 28 была изменена в соответствии с иммуноокрашивания мЭСК агрегатов. Для типичных антител, используемых в наших исследованиях и их разведения, обращаться к ранее опубликованная работа 19,21,24,25,29 и Таблица 3. Используйте многоканальную пипетку держать под углом (примерно 30 °), чтобы мягко удалить 150 мкл среды из бокового OF каждую лунку 96-луночного планшета. Промыть два раза с помощью пипетки 150 мкл PBS в каждую лунку. Оставьте пару минут между каждым стирки, чтобы позволить агрегаты, чтобы обосноваться. Установка P1000 пипетки обойтись 200 мкл, приложить соответствующее пипетки и отрезать примерно 3 мм от конца наконечника с парой стерильными ножницами. Draw часть PBS в течение каждую лунку 96-луночного планшета короткий путь в наконечник и удалить его перемешивание агрегат. Используйте тот же совет, чтобы составить весь объем в скважине, включая совокупность и пипетки в небольшой (30 мм диаметр) стекла Drosophila вскрытия хорошо. Перенос всех агрегатов из 96-луночного планшета, которые будут подвергаться одинаковые режимы иммунное окрашивание в тот же стекла вскрытии также. Примечание: Используйте новый наконечник пипетки вырезать при передаче агрегаты из разных экспериментальных условиях, чтобы предотвратить вынос агрегатов. Поместите стеклянную хорошо, что содержит AggregatES на рассечение микроскопом. Вихревой стекло хорошо, чтобы заставить агрегатов до центра и аспирации PBS с одной стороны хорошо со стеклянной пипетки Пастера. Используйте микроскоп, чтобы гарантировать, что агрегаты не с придыханием. Оставьте небольшой объем PBS в стеклянной скважины для покрытия агрегатов, чтобы предотвратить их от высыхания. Добавить 1 мл свежеприготовленного формальдегида (4%), растворенного в PBS и инкубируют в течение 2 ч при 4 ° С на орбитальном шейкере, установленным на низкой скорости. Внимание: параформальдегид, как известно, аллергенным, канцерогенным и токсичным. Носите соответствующую защиту в то время обработки. После фиксации, аспирации раствора формальдегида таким же образом, как описано в разделе 4. 1. 4 и мыть агрегаты с 1 мл PBS, три раза, в течение 10 мин для каждой промывки, на орбитальном шейкере, установленным на низкой скорости. Аспирируйте PBS, как описано в разделе 4. 1. 4 и выполнить еще три, 10 мин промывок PBS, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 0,2% три-т Х-100 (PBSFT). Выполните мин моет 10 на орбитальном шейкере в низкой скорости. Примечание: Использование плода бычьей сыворотки (FBS) приводит к четкой промывочным буфером, уменьшая количество агрегатов, которые могли бы быть потеряны в течение протокола, если был использован молоко. Важно отметить, что после записи, иммуногистохимические процедуры могут выполняться в других, чем те, которые подробно ниже различными способами, и должны быть определены и оптимизированы исследователем. Блок агрегаты течение 1 ч при 4 ° С в PBSFT на орбитальном коромысла установлен с низкой скоростью. Протокол может быть приостановлена ​​на данном этапе, и агрегаты заблокированы O / N, при постоянном помешивании в горизонтальной конусной качалке при 4 ° С. Аспирируйте PBSFT, как описано выше (смотри раздел 4. 1. 4) и инкубируют агрегаты с 500 мкл требуемой первичного антитела, разбавленного в PBSFT O / N при 4 ° С на орбитальном шейкере, установленным в низкой скорости. Накрыть парафиновой пленки, чтобы предотвратить испарение. Вторичный инкубации антитела Аспирируйте решение первичного антитела и промыть 1 мл PBSFT (при 4 ° С) следующим образом: два раза в течение 5 мин; Трижды в течение 15 мин; и от четырех до семи раз в течение 1 часа. Выполните каждый шаг стирки при 4 ° С, а на орбитальной качалке с установленным на низкой скорости. Примечание: Холод мыть Перед использованием в среду. Не выполняйте моет на льду, как это может привести к агрегатов для фрагмента. Аспирируйте последней промывки среду и инкубируют агрегаты с требуемой вторичного антитела в 500 мкл PBSFT O / N при 4 ° С в темноте на горизонтальном вращающемся качалке. Добавить окрашивающим ядра, такие как Hoechst при необходимости. Монтаж и изображений конфокальной микроскопии по Вымойте агрегатов, как описано в разделе 4. 1. 4 с 4 ° C PBSFT. После последней промывки прополоскать агрегаты 1 мл PBS, содержащий 0,2% FBS и Triton X-100 (PBT) следующим образом: два раза в течение 5 мин; Трижды в течение 15 мин. Выполните моетпри комнатной температуре на орбитальном качалке в защищенном от света. Аспирируйте среду, как описано ранее (раздел 4. 1. 4) и инкубируют в течение 30 мин в темноте с 1: 1 растворе глицерина: PBT (1 мл) с последующей второй 30-минутной инкубации с 7: 3 раствора глицерина: ПБТ (1 мл). Примечание: Смешать глицерин и решения PBT при 4 ° С с использованием поворотного устройства. Аспирируйте окончательное глицерин: решение ПБТ и заменить 1 мл монтажных среду 24. Протокол может быть приостановлена ​​на данном этапе перед монтажом (если паузу, герметизации скважины с парафиновой пленки и хранить окрашивание лунки при 4 ° С). Установите агрегаты на предметных стеклах с помощью пипетки их в 17 мкл капель с кончика сократить P20 (рис 2). Сложите двухсторонний скотч обратно на себя четыре раза, чтобы произвести распорки и приложите к каждому концу слайда. Место верхней покровное (22 мм х 60 мм) от этих прокладок (рисунок 2). Примечание: очень важно, чтобы вырезать наконечникиспользован на этой стадии так, чтобы не повредить образцы. Прокладки предотвратить покровное сокрушительное агрегатов. После того, как агрегаты установлены, изображения образцов с использованием конфокальной микроскопии, используя протоколы ранее описано 19,21,24,25. После размещения на микроскопе, оставьте в покое на слайд стадии в течение нескольких минут, чтобы позволить агрегаты урегулировать в монтажной среды.

Representative Results

Появление клеток Сразу после посева и после агрегации Сразу же после посева, можно наблюдать присутствие отдельных клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с использованием стандартного перевернутой тканевых культур микроскопом (Фиг.1В). В 8 часов обшивки, эти клетки будут начали спускаться на дно колодца силы тяжести и начали объединяться в дискретных кластеров (рис 1в). После 24 часов, то сливающиеся клетки завершили первичную агрегацию, и будет уплотнен в четко определенных, пока рваные агрегатов, где отдельные клетки нечеткие друг от друга (рис 1D). К концу второго дня (48 ч), агрегаты должны выглядеть "чистой", приняв на все клетки внутри скважины (рис 1E); дно колодца может иметь некоторые клетки, которые были пролить от совокупности на данном этапе. Обеспечениечто агрегаты были объединены в N2B27, в это время точки, они должны быть сферическими, приблизительно 150-200 мкм в диаметре и свободно перемещаться внутри скважины (т.е.., не приклеена к нижней части лунки). Агрегация в других средствах массовой информации (т.е.., ESLIF или N2B27 с конкретными факторами) имеет потенциал, чтобы изменить как первоначальный совокупный морфологию и ответ на последующих стимулов (Тернер и др., В процессе подготовки). Представитель Морфологические изменения Добавление 24 ч импульса вторичного среде, содержащей Чи между 48 и 72 ч (1А, 5А) генерирует также определяется удлиненные агрегаты, которые показывают, поляризованный выражение в специфических маркеров зародышевых слоев 19,21. Сразу же после импульса Chi (72 ч), агрегаты начнут пролить клетки и начинают показывать свой ​​ответ на эти сигналы в направлении к концу этого дня (Фигура 3А). Эти ответыпроявляются изменения в экспрессии генов и морфологии, оба из которых зависит от обработки, что агрегаты получили после первоначального 48 ч агрегации период N2B27 (фиг.3В). Если только анализ конечной точки не требуется, оптимальное время для изображения агрегатов находится примерно 96-120 ч. В этот момент агрегаты будут разработаны четкие морфологии и экспрессию генов (фиг.3А), а их размеры и масса по-прежнему достаточно низкой, так что выброс среды от P200 пипетки достаточно, чтобы сместить любые, которые могут быть прикреплены. Непредотвращение крепление агрегата к колодцу отрицательно скажется на совокупный образование (рис 5Biv). Морфологии и экспрессии генов образец агрегатов могут быть изменены в зависимости от обработки. Представитель результаты длительных или импульсных режимах с одной или лечения или комбинации факторов приведены для ВМР4, Dorsomorphin H1 (BДепутат ингибитор рецепторов), ActivinA, SB43 (активин / Узловая ингибитор), оФРФ или PD03 (ингибитор МЕК) (3В). Совокупный изображений и количественный анализ изображения Агрегаты поддаются визуализации либо широкопольными микроскопии (в основном для покадровой съемки 19), или фиксированная и иммунологически для конфокальной микроскопии 19,21 (Рис.2). В настоящее время описание протокола и изображений выше, позволяет количественная информация, которые будут получены от этих агрегатах. После конфокальной или широким полем захвата изображения, длина и соответствующий экспрессии генов вдоль диаметра или позвоночника агрегата (сферической или удлиненной, соответственно; фиг.4А, В) может быть измерена. Эти анализы также непосредственно применимы к покадровой изображений, где можно получить информацию о скорости роста, размера и относительного удлинения агрегатов при различных условиях (рис 4 </strong>). Рисунок 1. Типичное время курс и в начале морфологии. (A) Типичное время-курс для агрегации экспериментов. Клетки объединяются в течение 48 ч в N2B27, содержащий суспензию ЭС клеток мыши (10 клеток / мкл) в 96-луночный планшет (P1, P2). (Б) немедленно после посева (T = ~ 5 мин), отдельные клетки могут быть видно в суспензии и начали образованию комков от 8h (C). (D) Через 24 часа клетки образовали единое агрегат в каждую лунку, которая приблизительно 100 мкм в диаметре. (Е) После агрегации 48 ч, совокупный Диаметр варьируется от 150-200 мкм. В этот момент, агрегирование среднего (N2B27) удаляется и вторичный среду добавляют либо для остальной части эксперимента (P1 в части А) или в течение 24 ч перед тем, как изменилось бПодтверждено, чтобы N2B27 (p2 в части А). Масштабная линейка представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Монтажные агрегаты на предметных стеклах. После того, как агрегаты были зафиксированы, иммунологически и помещают в среду монтажа, каждый агрегат пипеткой на предметное стекло микроскопа, как 17 мкл капли (A, B, B '). Достаточно места остается между совокупным капель для предотвращения их слияния. Распорки сделаны с помощью двухсторонней ленты и помещены на каждом углу предметное стекло (A, A ', B). Именно на них, что стакан покровное помещается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <p class="jove_content" fo: keep-together.within-странице = "всегда"> Рисунок 3. Влияние различных обработок на морфологию клеток агрегированных ES. После 2 дней в N2B27 ЭС клетки образовали агрегаты. Добавление специфических факторов либо как 1 день импульса (A) или непрерывно (B) может привести к изменению фенотипа агрегатов по отношению к полярности экспрессии генов, относительное удлинение потенциала, или их общую форму. Примеры в этом рисунке агрегаты, образованные из любой бюстгальтер :: GFP 30 (А) или Sox1 :: GFP 27 (В) ЭС клетки мыши вошедшие после 120 ч и обработанные, как указано. Чи: Чир 99021 31; SB43: СО четыреста тридцать одна тысяча пятьсот сорок две 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию гоэто цифра. Рисунок 4. Количественный анализ агрегатов. Типичный агрегат образуется из бюстгальтер :: GFP mESCs 25,30 Следующие 24 ч импульса Чи и отображаемого на 120 ч. Объединенного изображения яркого поля и GFP канала показан с сегментированным линии, обозначающей '' позвоночник из совокупности из точки А в точку Б (а), вдоль которого флуоресценции и длина агрегата может быть измерена (B). Длина (С) и "округлость" (Д) от 24 агрегатов в пределах одного эксперимента показаны. Форма дескрипторов, таких как округлость (D), округлости, периметра и площади могут быть измерены с помощью анализа изображений Cookbook плагин из анализа изображений программное обеспечение ФИДЖИ 35. Среднее обозначено горизонтальной линией на каждой временной точке;планки погрешностей показывают стандартное отклонение; бар шкала в (А) показывает, 200 мкм. Как есть тонкие различия между линиями клеток репортерных, ожидается, что после того, как импульс Чи, средняя максимальная длина и средний минимальный округлость агрегатов будет меняться. Между различными клеточными линиями, мы находим, что средняя максимальная длина может быть в пределах от ~ 400-800 мкм и средней минимальной округлости между 0,4 и 0,6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5. Примеры неудач в образование агрегатов. Способность генерировать воспроизводимые агрегаты (а) зависит от критических факторов, таких как (BI) свежей и хорошо перемешанной вторичной среды, (BII, BIII) точность в подсчете начального Nхариус клеток и (BIV), обеспечивающих агрегаты не образуют прилипшие колонии т.е.., '' крах в поверхности скважины. Типичные примеры ошибок в образование агрегатов для каждого из указанных условий (В) показаны. Масштаб-бар, как указано; см Устранение неисправностей таблицу для деталей (таблица 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Таблица 1. Руководство по устранению неполадок. Типичные ошибки, связанные с протоколом агрегации даны с предложениями, как к их решению. Таблица 2. Таблица испытанных клеточных линий для формирования AGGregates. Ряд клеточных линий 19,22,27,30,36-40 были охарактеризованы для формирования агрегатов и, хотя тонкие различия между клеточными линиями, как ожидается, и наблюдались, все вышеуказанные линии показывают аналогичную динамику в плане удлинения и морфологии. С точки зрения экспрессии генов, паттерн экспрессии специфичен для ген выражается, но в пределах каждой клеточной линии, паттерн экспрессии, как правило, соответствует в течение нескольких пассажей. Для согласованности, мы генерируем агрегаты из клеток, которые не превышали 15 проходов в культуре. Таблица 3. Список представительств антител, используемых в этих исследованиях. Выбор антител и факторов разбавления совокупного иммунной окраски.

Discussion

Описанная методика в этой рукописи эффективно и воспроизводимо создает агрегаты мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), которые отображают организована нарушения симметрии и удлинения 19, сочетающая культуру висячей капли, описанный Marikawa др. 14 и EB формирования. Эти агрегаты перейти к разработке осевых удлинения, дополняя существующие методы для генерации передних органов с ЭС клеток, таких как оптические чашки 11 и коре головного мозга 13, и содержат клетки с идентичностей трех зародышевых листков, которые отображают процессы, аналогичные тем, которые во время гаструляции таких, как быстрое движение клеток 19,21.

Это интересно порассуждать о природе случае нарушения симметрии, так как это происходит в отсутствие внешних паттерна тканей и зиготический асимметрия киев 19. Спонтанное образование зачаточном оси может возникнуть из уже существующих heterogeneities в стартовом культуры клеток, которые формируют основу для развития асимметрии. Действительно, популяции клеток, культивируемых в условиях ESLIF отображения смесь самообновлению и дифференциации клеток, относительные пропорции которых могут изменяться от одного агрегата к другому. Кроме того, предварительная работа в нашей лаборатории предполагает, что агрегаты из полностью плюрипотентных клеток населения показывают, задержка развития и дефекты в формировании паттерна, предлагая роль неоднородности в формировании организованной шаблон (Д. Тернер и А. Мартинес Ариас, в процессе подготовки). Стоит также учесть, что механизм реакции-диффузии может генерировать образец, с диффузией ингибитора от поверхности агрегата. Warmflash др. 41 полагают, что такой механизм может быть ответственным за разработку радиального асимметрии в прикрепленной культуре, что делает его возможным кандидатом на паттерна в трех измерениях.

Во время Первол 48 ч период агрегации, клетки достигают состояния, аналогичную в постимплантационного эпибласта, в котором они компетентны отвечать на сигналы от вторичной среды 19,21,24. Как правило, протокол, описанный здесь, обеспечивает клетки с импульсом вторичной среды, которое содержит факторы (такие как агонисты Wnt / β-катенин), которые обеспечивают сигналы, достаточные для удлинения. Предыдущие способы культивирования, описанные Ланкастер и др. (С использованием ЭСК человека 13) и Eiraku др. (С mESCs 11) используется короткий период агрегации в низкой адгезии 96-луночные планшеты, прежде чем агрегированные клетки были переданы капель матригеля сотрудников, проводящих собирается культуру. Хотя время между агрегации и Матригель вставки отличалась между исследований, в обоих случаях, большое количество клеток были использованы для образования агрегатов (примерно 3,000-4,500 клеток). В отличие от этого, протокол, описанный здесь, использует 19 гораздо меньше клеток (примерно 400 клетокза совокупности), который был определен, чтобы быть абсолютно необходимым для процесса удлинения, нарушения симметрии и поляризации, которая наблюдается 19. Кроме того, эти удлиненные структуры могут быть созданы в гораздо более короткий период времени без встраивания в искусственных матриц: сравнить поколение определенных областей мозга с помощью Ланкастер и др (> 20-30 дней) 13 и оптические чашки от Eiraku. и др. (~ 11 дней) 11 с 5 дней, необходимых для генерации поляризованных удлиненных структур.

Одно из ограничений с помощью метода, описанного здесь культуры, однако, является то, что они могут быть культивированы только в течение примерно 5-6 дней после посева, пока их размер не делает их компетентным в соответствии с тяжести опускаются на дно лунок и заставить адгезию даже на не -покрытие пластиковой посуды. Дальнейшие эксперименты с использованием искусственных матриц, таких как те, которые упомянуты ранее, может позволить нам увеличить срокнаблюдение и экспериментирование, и работа на постоянной основе, чтобы определить влияние ограничения агрегаты таким образом. Еще одно ограничение этого метода является то, что для того, чтобы изменить среду без удаления агрегатов, небольшой объем среды должны быть оставлены в нижней части скважины. Последствия для химических генетики подходов необходимость рассмотреть этот разбавление и остаточных эффектов от предыдущего СМИ: в день 3 мкМ Чи импульса, 2,37 мкМ раствор на самом деле доставлен, и последующие изменения средних привести в перенесенных из 0,499 мкМ (72-96 ч) и 0,105 мкм (96-120 ч) между временных точках. Текущая работа не корректируется для разбавления и предполагается, что ежедневные изменения среднего позволит свести к минимуму остаточные эффекты.

Есть ряд важных шагов в протоколе по обеспечению и внутри- и межрегиональных экспериментальную воспроизводимость. Во-первых, начиная культура mESCs должны быть в хорошем состоянии и не более СОnfluent и среднего всегда должен быть хорошего качества т.е.., свежий и хорошо перемешана (5А, В). Плохие условия культуры отрицательно влияют на агрегацию (рис 5Bi). Точная подсчет клеток для получения суспензии ~ 400 клеток / 40 мкл клеток имеет важное значение, так как более крупные агрегаты не самоорганизовываться и, скорее всего, образуют двойные агрегаты в каждой скважины (рис 5Bii) в то время как более мелкие агрегаты не могут прийти к правильным Плотность, где они способны реагировать на стимул (рис 5Biii). Ключевым шагом оптимизации стало включение второго PBS мыть, который удаляет загрязнений сыворотку из клеточной суспензии (шаг 2.6); это улучшило частоту агрегации и ускоренное развитие агрегатов примерно на 24 часов. Далее, обеспечивающие изменения средних применяются с достаточной силой, чтобы выбить любые агрегаты, которые имеют потенциал, чтобы присоединиться к поверхности скважины; Невыполнение этого RESULTS в "сбой" агрегатов (рис 5Biv). Кроме того, как упоминалось ранее (и ниже), очень важно, чтобы гарантировать, что агрегаты сохраняются в суспензионной культуре и предотвратить прилипание к любой поверхности. После того, как агрегаты придерживались, картина экспрессии генов и их удлинение потенциала нарушается.

В этот метод является относительно простым, и в пределах компетенции людей с хорошим методов тканевых культур, большинство проблем, связанных с агрегацией может быть решена относительно быстро, если эти критические шаги выполняются; полный стол устранения неисправностей доступен (Таблица 1). После того, как освоили этот метод может быть использован для изучения осевого развития, нарушение симметрии и клетка-решения события. Более конкретно, эти агрегаты имеют потенциал для создания пулов клеток, которые до сих пор были недоступны в культуре, например, спинного мозга и мотог нейроны.

Этические Примечание: Следует с должной осторожностью отметил, что перевод этого протокола на человека ES или IPS культуре клеток может привести экспериментатора близко к правовой основе четырнадцати дневного срока на исследования эмбриона человека, а именно генерации первичной полоски, как описано в оплодотворению и эмбриологии человека Закона о 2008 (Великобритания) 42. Поскольку Закон охватывает все живые человеческие эмбрионы, независимо от их манеры создания, культура человека gastruloids за пределами первобытного-полоски, как стадии будет за рамки лицензируемой исследований.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансируется за счет ERC Advanced следователь премии AMA (в DAT, ТБ) с вклада гранта проекта от Wellcome Trust в AMA, в EPSRC студенчества к PB-J и Эразма, Stichting др. Хендрик Мюллер Vaderlandsch Фон и Fundatie ван де Vrijvrouwe ван Renswoude те 'ы-Гаага, чтобы SCvdB. Мы хотим поблагодарить J. Бриско, С. Муньос-Descalzo, К. Шретер и Т. Родригес, для обсуждения и конструктивную критику, Хоакин де Наваскес для монтажа средней протокола и оба АК Hadjantonakis и С. Budjan для обмена протоколы своей лаборатории в относящиеся к окрашиванию целых монтажа эмбрионов. Более ранняя версия этой статьи была ранее размещена на сервере bioRxiv Препринт 29.

Materials

2-Mercaptoethanol Gibco/Invitrogen 31350-010
25cm2 Cell Culture Flask Grenier Bio-one 690 175
Benchtop Centrifuge MSE MSB020.CX1.5
BES Buffered Saline (BBS) Sigma-Aldrich B2891 BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl 
Centrifuge tubes (15 or 50ml) Greiner Bio-One  118271 or 227261
CHIR 99021 (Chi) CSCR n/a Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO
Dissection Well (30mm Internal Diameter) Fisher Scientific 12678586
ESLIF 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units).
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1090/500
Gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use.
Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
GlutaMAX Gibco 35050-038
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Improved Neubauer Haemocytometer Hawksley AS1000
Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant CSCR n/a Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute.
n-Propyl-gallate Sigma-Aldrich 02370
N2B27/NDiff 227 Stemcells, Inc. SCS-SF-NB-02 http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Non-Essential Amino Acids Gibco/Invitrogen 11140-035
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148 Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8662 With Calcium and Magnesium
Sodium Pyruvate Invitrogen 11360-039
Sterile Reservoir STARLAB E2310-1010
Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate Grenier Bio-one 650185
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  3. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
  4. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
  5. Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
  6. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
  7. ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
  8. Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
  9. Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
  10. Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
  11. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  12. Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
  13. Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  14. Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).
  15. Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
  16. Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
  17. Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
  18. Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux’Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
  19. van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
  20. Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  21. Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
  22. Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
  23. Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
  24. Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias, ., A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
  25. Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
  26. Ying, Q. -. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  27. Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  28. Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. . Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).
  29. Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
  30. Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
  31. Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
  32. Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
  33. Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
  34. Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
  35. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  36. Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
  37. Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  38. Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).
  39. Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
  42. . . Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 – Elizabeth II. , (2008).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsEmbryoid BodySelf-organizationSymmetry BreakingAxial ElongationCell Fate SpecificationGastrulation-like MovementsImmunocytochemical AnalysisAxial DevelopmentCellular Decision-making

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro. J. Vis. Exp. (105), e53252, doi:10.3791/53252 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image