Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis
Summary
We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
Abstract
Veel micro-organismen kunnen produceren en uitscheiden exopolysaccharides (EPS), die belangrijke gevolgen medische gebieden, voedseltoepassingen of de vervanging van petrochemische derivaten hebben. We beschrijven een analytische platform te automatiseren op een liquid handling systeem dat de snelle en betrouwbare analyse van het type en de hoeveelheid EPS geproduceerd door micro-organismen toestaat. Het stelt de gebruiker in staat om nieuwe natuurlijke microbiële exopolysaccharide producenten te identificeren en het koolhydraat vingerafdruk van de overeenkomstige polymeren binnen een dag analyseren high-throughput (HT). Met behulp van dit platform, kunnen stam collecties evenals bibliotheken van stam varianten die in technische oplossingen zouden kunnen worden verkregen worden gescreend. Het platform heeft een modulaire opbouw, die een scheiding van het protocol in twee grote delen mogelijk maakt. Ten eerste is er een geautomatiseerde screening systeem, dat verscheidene polysaccharide detectiemodules combineert: een semi-kwantitatieve analyse van viscosity vorming door een centrifugatie stap een analyse van polymeervorming via alcoholprecipitatie en de bepaling van het totale koolhydraatgehalte via een fenol-zwavelzuur transformatie. Hier is het mogelijk om op het scherm tot 384 stammen per run. Het tweede deel bevat een gedetailleerde monosaccharide analyse van alle geselecteerde EPS producenten die in het eerste deel door twee essentiële modules: de analyse van de totale monomeersamenstelling via high performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan ultraviolet en electrospray ionisatie ionenval detectie ( UHPLC-UV-ESI-MS) en de bepaling van pyruvaat als polymeer substituent (aanwezigheid van pyruvaat ketal) via enzymatische oxidatie die gekoppeld is aan een kleurvorming. Alle analytische modules van deze screening platform kunnen worden gecombineerd op verschillende manieren en aangepast aan de individuele eisen. Bovendien, ze kunnen allemaal worden handmatig verwerkt of uitgevoerd met een vloeistofverwerking systeem. Daarbij, de screening plaTForm maakt een enorme flexibiliteit om verschillende EPS identificeren.
Introduction
Microbiële exopolysaccharides (EPS) zijn structureel zeer diverse groep van polymeren die verschillende biologische functies vervullen. Meestal zijn opgebouwd uit complexe herhalende eenheden, die worden onderscheiden door verschillende typen monomeren (suiker, suikerderivaten, suikerzuren), de bindingen tussen de monomeren en hun vervangingen. De structurele diversiteit van microbiële polysacchariden verleent nogal verschillende kenmerken van de leden van deze molecule klasse, die hun toepassing in verschillende gebieden, zoals voedsel 1 toelaat, cosmetica 2,3, bouw chemie 4 of waterbehandeling 5. Om het toepassingsgebied van deze bio- dergelijke duurzame polymeren de identificatie van nieuwe natuurlijke microbiële polysachariden en de engineering van uitvoeringsvarianten vormt werkvorm verder uitbreiden. Hoe dan ook, is een snelle screeningsmethode nodig zijn om snel een groot aantal microbiële stammen voor thei scannenr polysaccharide vormen, en hun producten te analyseren. Daarom hebben wij onlangs een 96-well HT-screening platform voor de analyse van microbiële polysaccharideproductie uit natuurlijke isolaten of aangelegde stamvarianten dat de identificatie van de monomere samenstelling 6 omvat.
Toegepast platform voor een eerste screening ronde van ~ 500 natuurlijke isolaten lieten identificeren slechts ongeveer 10 tot 20% van de bekomen stammen als het kunnen produceren EPS (gegevens niet getoond). Dit betekent dat 80-90% van de geanalyseerde stammen niet EPS onder de toegepaste omstandigheden produceerde, en dus een verdere analyse van de gedetailleerde koolhydraat vingerafdruk niet nodig. Aangezien dit zeer verfijnde identificatie van de monomere samenstelling een tijdrovend proces, vooral voor gegevensanalyse, snel pre-screening methode om de stammen positief EPS productie identificeren drastisch de efficiëntie. Voorts reagentia,verbruiksartikelen en meettijd op UHPLC UV-ESI-MS worden verminderd. Bovendien, de verschillende analytische modules, terwijl aan de ene kant maakt de werkwijze zeer betrouwbaar zijn anderzijds complicerende het manueel hanteren van meer dan twee 96-well platen in parallel, en als zodanig het volledige potentieel van de werkwijze beperkt. Om deze redenen hebben we besloten om een geautomatiseerde screening platform te ontwikkelen. Daarom combineerden we de modulaire indeling van de vingerafdruk koolhydraat bestaande techniek van een volledige snelle detectiemethode van het totale suikergehalte, gebaseerd op absorptiemeting.
De fenol-zwavelzuur methode vormt nog steeds de methode van de keuze voor de snelle bepaling van het totale koolhydraatgehalte van bacteriële en plantaardige polysacchariden 7,8. Deze werkwijze werd eerst beschreven door Dubois et al. 9 en aangepast voor verschillende toepassingen en steekproefomvang, zelfs voor kleine schaal in 96-well platen 10,11. de phenol-zwavelzuur methode meet het totale koolhydraatgehalte één waarde sommeren van alle monomere, oligomere en polymere koolhydraten van de monsters.
Rekening houdend met deze aspecten rekening, de keuze van een geschikt kweekmedium is essentieel om deze methode toe te passen. Complexe media die oligomere of polymere koolhydraten verbindingen zoals gistextract zou kunnen leiden tot een veranderde polymeergehalte en daarom moet absoluut vermeden worden. Bovendien worden grote hoeveelheden suiker als C-bron voor de kweek van de stammen. Hoge niveaus van resterende koolhydraten uit het teeltproces kan negatief interfereren met de meting van de EPS inhoud.
Daarom wordt het gebruik van gedefinieerde en zuivere suikers geadviseerd. In onze experimenten gebruikten we glucose voor het kweken van de cellen. De resterende glucose na kweek werd gereduceerd via een gelfiltratie en bepaald via een glucose-assay. Tenslotte de glucose-equivalents van de polysacchariden werd berekend door de resterende glucose na gelfiltratie van het totale koolhydraatgehalte die waargenomen waren met het fenol-zwavelzuur methode. Gelfiltratie en glucose-assay in combinatie met fenol-zwavelzuur methode betrouwbare resultaten en kunnen zijn onze eerste, volledig geautomatiseerd detectiesysteem.
Twee nieuwe analytische modules in de geautomatiseerde screening platform om de hoeveelheid informatie van de EPS-detectiesysteem verhogen: de neerslag en de waarneming van een toename van de viscositeit.
Vele verschillende EPS – bijvoorbeeld succinoglycan, xanthan en colon acid 12 – gemeld worden aangepast met een niet-koolhydraat pyruvaat ketaal suiker positie C4 en C6. Die pyruvaat ketalen (net zoals succinyl halfesters en uronzuren) bijdragen aan de polyanionische natuur en daarom de fysieke properties van het polymeer door interactie via tweewaardig kation bruggen 13. Om deze bepaalde polymeren identificeren de bepaling van pyruvaat werd als een aanvullende analyse module. Hierdoor wordt de informatie over de polysaccharide substituenten en hun potentieel macroscopische eigenschappen.
Combineren van alle modules maakt de identificatie van verschillende EPS evenals een snelle en efficiënte bepaling van EPS producenten. Door dat de aanpak van de screening platform kan worden onderverdeeld in twee grote delen (figuur 1). In de geautomatiseerde screening (deel I) de workflow optreedt volautomatische (tabel 1) om snel preselectie EPS producerende stammen. Het koolhydraat vingerafdrukanalyse (deel II) bepaalt kwantitatief de monomeersamenstelling van de EPS door de vooraf gekozen stammen. Daardoor werd de gegevensanalyse geminimaliseerd teneinde de screening van grote stammenverzamelingen optimaliseren. Dezebiedt de mogelijkheid om 384 stammen in één geautomatiseerde screening run en met twee runs die per dag van 768 stammen per dag mogelijk zijn te analyseren. Bovendien, het koolhydraat vingerafdrukanalyse geeft een nog meer gedetailleerd overzicht van alle geïdentificeerde EPS. Dit maakt de gerichte analyse en identificatie van slechts licht verschillen EPS varianten of geheel nieuwe vergelijking met de reeds beschreven chemische structuren van EPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysaccharide detectie met fenol-zwavelzuur methode: Verschillende monosacchariden tonen verschillende absorptiemaxima en molaire extinctie coëfficiënten met behulp van deze methode 9. Dit resulteert in verschillende absorptiemaxima van polymeren, die verschillende suikers in verschillende hoeveelheden. De verschillende golflengten van absorptiemaxima voor 16 verschillende commerciële polymeren worden in tabel 5. De polymeren werden opgelost (1 g / l) in DDH 2 O, geroerd (150 rpm) gedurende de nacht en gemeten met fenol-zwavelzuur-werkwijze . Diutangom toonde de laagste absorptiemaxima bij 470 nm en scleroglucan en hyaluronzuur de hoogste bij 484 nm. Op basis van deze resultaten werd 480 nm gekozen voor deze screening platform. De relatieve absorptie van de polymeren werd berekend op basis van de absorptie verkregen met 1 g / l glucose (ingesteld op 100%). De laagste resultaten werden verkregen met scleroglucan en succinoglycan, beide met 92%. Dit was expecteerde omdat scleroglucan bevat alleen glucose en succinoglycan bevat glucose en galactose in een verhouding van 7: 1. Zowel commerciële polymeren hebben verschillende verliezen drogen en verschillende asgehalte, dit is de reden waarom de theoretische waarde van ~ 110% niet bereikt. Xylan toonde de hoogste relatieve absorptie met 311%. De reden hiervoor is de hoge molaire extinctiecoëfficiënt bereikt van xylose door het meer dominante furanose vorm. In een gehalte van 0,1 g / L glucose werd de detectielimiet bereikt, evenals de detectielimiet bij een concentratie <0,05 g / l. De detectielimiet voor positieve spanningen in de screening hoger is dan 0,7 g / L en Aldus was de zuiverheid presteerde goed. Om betrouwbare resultaten, de resterende glucose na gelfiltratie werd bepaald met een glucose-assay en deze waarde werd afgetrokken van de waarde van het fenol-zwavelzuur methode.
Geautomatiseerde glucose-assay verdunning: De voorstellingvan de glucosebepaling na kweken (verdunning 1: 100) werd onderzocht. Hiervoor werden 10 pl supernatant overgebracht naar 990 ul van DDH 2 O in een diepe put plaat en gemixt via tien keer opzuigen en afgeven van 180 ul van deze verdunning. De tweede kritische stap was het correct pipetteren van slechts 5 pl aliquot van de 1:10 verdunning van de glucose-analyse na gelfiltratie. Om de verdunning 25 pl DDH 2 O genereren overgebracht met een 50 eerste ul-tip werd vervolgens 20 ul DDH 2 O en 5 pl gel-filtraat elkaar afgezogen. Dit zorgt voor een betere verwijdering van de 5 pl aliquot uit de punt. Beide verdunningsstappen werden geverifieerd met verschillende glucose standaarden via een glucose-assay. De resultaten van twee voorbeeldige concentraties zijn in tabel 6 de 1:. 100 verdunning voor het bepalen van het glucosegehalte na kweken vertoonden grote nauwkeurigheid voor beide standaarden met een CV & #60; 1,2%. Tegelijkertijd de nauwkeurigheid voor de hogere standaard was tot 11,6 (% fout). Dit is echter verwaarloosbaar als glucosebepaling vertegenwoordigt alleen de resterende glucosegehalte na kweek en daarom niet van belang voor het polymeer detectie. De verdunning van 1:10 voor de resterende glucose na gel-filtratie toonde zeer betrouwbare resultaten met een CV <1,4% en een nauwkeurigheid <2,1% fout.
Behandeling verdamping: The screening vereist 3,5 h uit de eerste stap om de eerste glucose-assay. Om te weten te komen, of dit tijdsbestek heeft een invloed op de afgetopte MTP opslag, 50 pi glucose-assay kalibratienormen werden opgeslagen met en zonder dekking voor 3,5 uur in de robot carrousel. In de kalibratie bereik (45 tot 4,5 mg / l) nauwelijks gestegen het monster concentratie. Een toename – door verdamping – was onder 2,1% en alleen de twee laagste concentraties (1,8 en 0,9 mg / l) reikte tot 12,4% ( <strong> Tabel 7).
Gelfiltratie: hoge hoeveelheden niet-gemetaboliseerd glucose verstoren de kwantitatieve detectie van glucose uit het gehydrolyseerde polymeer. Daarom werd een gel-filtratiestap vereist om de resterende glucose na kweek te verwijderen. Bovendien, de gelfiltratie zuivert het polymeer bevattende supernatant van zouten en koolhydraten monomere verbindingen, andere dan glucose, de analytische achtergrond in het monomeer analyse te minimaliseren. Voor deze gelfiltratie stap 35 pl van het filtraat werden in het midden van de put. Om waarmerking van de robuustheid van gelfiltratie in het automatische systeem werden acht kalibratienormen van 0,045 tot 9 g / l glucose gefiltreerd (n = 8). Het glucosegehalte van elke concentratie werd steeds met meer dan 95% van de oorspronkelijke waarde (Tabel 8). Daarbij de gel-filtratie vertoonde zeer goede resultaten in verschillende concentraties glucose. Daarnaast is de resterende glucose na gel-filtration werd ook bepaald met een glucose-assay en afgetrokken van het fenol-zwavelzuur wil om de juiste hoeveelheid glucose-equivalent te ontvangen voor het gehydrolyseerde polymeer.
Pyruvaat-assay: Ten eerste werd onderzocht of het geneutraliseerd en verdund (1:10) TFA-matrix van de hydrolysestap interfereert met de enzymatische reactie. Daarom werd de volledige test tweemaal uitgevoerd, eenmaal met en eenmaal zonder matrix en toonde betrouwbare resultaten. Tenslotte werd de pyruvaatgehalte van 16 commercieel verkrijgbare polymeren succes gemeten en is weergegeven in figuur 3. Het is algemeen bekend dat uit deze 16 polymeren alleen succinoglycan en xanthaan bevatten van nature pyruvaat. Met onze pyruvaat-assay beide polymeren werden correct geïdentificeerd. In scleroglucan werd welan gom en xylaan pyruvaat ook gedetecteerd in significante hoeveelheden. Kortom, het vermogen van de werkwijze werd gevalideerd en pyruvaat-assay showed een high performance. Het bleek te kunnen detecteren pyruvaat verschillende polymeren na hydrolyse.
Koolhydraten vingerafdruk: Na het uitvoeren van alle analytische modules in de geautomatiseerde screening, werden potentiële EPS producenten geselecteerd voor de koolhydraten vingerafdruk analyse. Hiervoor zijn verschillende criteria toegepast: 1) positieve waarneming van viscositeit na centrifugeren en / of na filtratie. 2) Neerslag vóór en na filtratie. Waargenomen vezels en vlokken werden beoordeeld als positief. 3) Glucose tegenwaarde van de fenol-zwavelzuur methode. Waarden> 700 mg / l werden als positieve waarden tussen 300 en 700 mg / l werden als vermeende EPS producenten. Wanneer twee of drie criteria werd beoordeeld als positief werden de stammen geselecteerd voor verdere koolhydraten vingerafdrukanalyse. De criteria kunnen worden aangepast op de individuele doel van de EPS screening (bijvoorbeeld lage viscositeit EPS). Onze aanpak gericht op het vinden efficient EPS producenten. Bij het zoeken naar stammen die alleen produceren kleine hoeveelheden EPS de evaluatie grens van het glucose-equivalent te verlagen.
Technische voordeel en toekomstige toepassingen: Een interessante eigenschap van dit protocol is het modulaire karakter van de stappen en de verschillende analytische modules. Ze kunnen worden gecombineerd op verschillende manieren, aangepast aan de individuele behoeften en nieuwe modules kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd. Bovendien kan de analytische modules afzonderlijk worden gebruikt, bijvoorbeeld de hydrolyse module in combinatie met de HT-PMP-derivatisatie module kan een monomere samenstelling analyse uit te voeren van verschillende polymeeroplossingen (1 g / l) in 96-well formaat. Laboratorium zonder toegang tot een vloeistofverwerking moet de gehele screening kan handmatig worden verwerkt zonder enige veranderingen in de regeling pipetteren. Het gebruik van een vloeistofverwerking verhoogt de doorvoersnelheid tot 768 stammen (in plaats van 192 stammen als Screened handmatig) per dag. Het protocol dat hier wordt beschreven, kan een screening voor verschillende genera en derhalve voor het screenen van grote stammenverzamelingen op nieuwe EPS producenten te identificeren en analyseren hun koolhydraat vingerafdruk in een benadering (figuur 4). Bovendien kan een doelgerichte screening op polysacchariden met zeldzame suikers zoals fucose, uronzuren of onbekende suikers worden uitgevoerd via de gedetailleerde monosaccharide analyse. Ook kunnen verschillende combinaties suiker in gedefinieerde verhoudingen worden gedetecteerd. Dit maakt de eenvoudige identificatie van structureel verwante varianten van reeds bekende of nieuwe EPS EPS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
Materials
| 96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
| Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
| Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
| MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
| A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
| 96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
| 96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
| 96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
| Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
| Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
| 96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
| 96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
| 200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
| 1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
| 96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
| TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
| Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
| Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
| ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
| DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
| Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
| Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
| Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
| 2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
| Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
| Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
| Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
| Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
| Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
| 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
| Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
| Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
| Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
| Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
| Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
| Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
| Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
| Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
| Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |
References
- Milani, J., Maleki, G., Valdez, B. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. Food Industrial Processes – Methods and Equipment. 2, (2012).
- Thibodeau, A. Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation. Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).
- Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer. Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).
- Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers. Appl. Rheol. 23 (5), 52903 (2013).
- Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment. , 51-81 (2013).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day. Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).
- Ortega-Morales, B. O., et al. Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria. J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).
- Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT. Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).
- Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
- Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed. Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).
- Sutherland, I. W., Dumitriu, S. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility. , 431-457 (2005).
- Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C., Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. , 258 (1999).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format. J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).
