Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
De mogelijkheid om stamcellen mutaties te meten, is een krachtig hulpmiddel om te kwantificeren in een kritische cel populatie of, en in welke mate, kan een chemische mutaties die kunnen leiden tot kanker veroorzaken. De toepassing van een enzymatische bepaling om stamcellen mutaties kwantificeren in de X-gebonden glucose-6-fosfaat-dehydrogenase gen is eerder gemeld. 1 Deze methode vereist de bereiding van ingevroren secties en incubatie van het doorgesneden weefsel met een reactiemengsel dat een oplevert blauw wanneer de cellen functioneel glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) enzym. Indien niet, de cellen lijken witachtig. We hebben het reactiemengsel met behulp van optimale Cutting Temperatuur Verbinding (oktober) medium in plaats van polyvinyl alcohol gewijzigd. Dit vergemakkelijkt pH meting verhoogt oplosbaarheid van de G6PD kleuring componenten en beperkt diffusie van de G6PD enzym. Om aan te tonen dat een mutatie zich in een stamcel, moet de gehele crypt G6PD enzymatische missenactiviteit. Alleen als een stamcel herbergt een fenotypische G6PD mutatie zullen de nakomelingen in de crypte gebrek G6PD enzymatische activiteit. Om crypten met een stamcel mutatie te identificeren, werden vier opeenvolgende aangrenzende vriescoupes (niveau) gesneden op 7 urn dikte. Deze benadering van het maken aangrenzende sneden worden conformatie die een crypte volledig gemuteerd aangezien dezelfde gemuteerde crypte zal worden waargenomen in aangrenzende secties. Slides met weefselmonsters die meer dan 50 urn uit elkaar waren bereid waren totaal> 10 4 crypten per muis evalueren. De mutatie-frequentie is het aantal waargenomen gemuteerde (wit) crypten ÷ door het aantal wild type (blauw) crypten in een behandelgroep.
Introduction
Darmkanker wordt gedacht dat blootstelling aan milieu-agenten en voedingscomponenten dat DNA kan beschadigen betrekken en produceren van activerende somatische mutaties in oncogenen (bijvoorbeeld ß-catenine) of inactiveren mutaties in tumorsuppressorgenen (bijvoorbeeld APC). Aangenomen wordt dat deze kritische mutaties optreden in colon stamcellen. Vanwege de unieke architectuur crypte van het colonepitheel is het mogelijk om stamcellen mutaties in het colon te meten na blootstelling van dieren aan chemicaliën geassocieerd met darmkanker. Verscheidene X-gebonden enzymen kunnen dienen als indicatoren voor de mutaties die voorkomen in stamcellen, de mutaties in alle cellen binnen een crypte zal zijn.
Voorheen werd een procedure gepubliceerd waaruit blijkt dat chemische stoffen die darmtumoren induceren in muizen ook gegenereerd somatische stamcellen mutaties in het colon via de analyse van mutaties in het X-gebonden glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) gen. 1-3De werkwijze kwantificeert het optreden van willekeurige mutaties in somatische stamcellen colon zonder selectiedruk. De procedure heeft betrekking op de productie van niet-gefixeerde bevroren dikke delen van behandelde en controle muizen en de identificatie van de crypten verstoken van cellen die functionele G6PD activiteit te produceren. Deze gemuteerde crypten, die wit verschijnen aan dat de mutatie zich in een stamcel die tot nageslacht gaf ook herbergt een gemuteerd gen G6PD. In de enzymatische assay, kan G6PD deficiënte mutant crypten niet oxideren glucose-6-fosfaat, die nodig is voor de reductie van nitro blue tetrazolium (NBT). Wanneer de G6PD enzym functioneel, de NBT de kleuring mengsel wordt gereduceerd tot oplosbare formazan en neerslagen accumuleren op de plaats van het enzym en "kleuring" blue cellen. Cellen die G6PD mutanten zijn blijven witachtig in tegenstelling tot blauw gekleurde wild type crypten. Deze methode meet mutaties die een "nul" fenotype hebben. Omdat nlZymes zoals G6PD kunnen diffunderen uit de cellen op een niet vastgelegde weefselsectie wanneer de secties in een waterige oplossing worden gebracht, is het noodzakelijk het enzym te stabiliseren in de weefselcoupes te analyseren. 4 De stabilisering van het enzym in het weefsel moet niet belemmeren diffusie van kleine moleculen reagentia voor de enzymatische reactie G6PD.
We hebben een aantal belangrijke wijzigingen in de oorspronkelijke procedure gemaakt. Het medium voor de kritische enzymatische kleuring is gewijzigd van polyvinyl alcohol Optimaal snijtemperatuur Verbinding (oktober), waarbij de pH controle en oplossen van de bestanddelen die in de test vergemakkelijkt. De kleuring wordt uitgevoerd met 0,4-0,5 ml wells van staal ringen zodat elke weefselsectie ontvangen hetzelfde volume van de G6PD reactiemengsel. Een procedure werd ontwikkeld voor het schatten van het aantal crypten per afgebeeld sectie die een grote bemonstering van het colon weefsel verschaft zonderhandmatig tellen> 10 5 crypten per colon. De analyse van aangrenzende 7 urn weefselcoupes verschaft visualisatie van een mutant crypte op meer sledes, die potentiële kleuring artefacten verminderd. Deze wijzigingen maken de procedure efficiënter en reproduceerbaar.
Met deze herziene protocol, hebben we de mutatiefrequentie in colon stamcellen gekwantificeerd na blootstelling van C57BL / 6 muizen azoxymethane, een bekend carcinogeen colon bij knaagdieren. 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
Vaak genotoxische effect van een verbinding wordt bepaald door zijn vermogen om DNA te wijzigen. Dit gebeurt normaal gesproken door het isoleren van het weefsel en het meten van het globale niveau van DNA adducten. Voor AOM, zou dit inhouden kwantificeren O 6 methylguanine adducten in de colon. Met deze aanpak gegevens over schade in specifieke celtypen, zoals in de stamcelniche, verloren. Verder een DNA adduct is niet hetzelfde als een mutatie aangezien slechts een klein deel van adducten uiteindelijk worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
