Yöntemler Küçük RNA'ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em> Plasmodium falciparum</em
Summary
Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.
Abstract
Orak hücre alel sorumlu genetik varyasyon (HbS) sıtma parazitinin, P. tarafından enfeksiyonu karşı eritrosit sağlar Falciparum. Multifaktöryel olduğu bilinmektedir, bu direncin, moleküler temeli, tam olarak anlaşılamamıştır. Son çalışmalar kez sıtma parazitleri transloke eritrosit microRNA, ayırıcı ifadesi, gen düzenlemesi ve parazit büyümesi hem de etkilediği bulundu. Bu miRNA'ların sonra parazit mRNA'ların gizli alt grupları ile 5 'RNA füzyon ile bir kimerik RNA transkripti oluşturarak mRNA translasyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir. Burada kullanılan teknikler gen regülasyonu ve P. translasyonel potansiyeline fonksiyonel rolü ve varsayılan mekanizma altında yatan eritrosit microRNA incelemek için falsiparum, ev sahibi eritrositlerin içine modifiye sentetik microRNA transfeksiyonunun dahil detaylı olarak açıklanacaktır. Son olarak, polisom gradyan yöntemi tra derecesini belirlemek için kullanılırBu transkriptlerin nslation. Birlikte, bu teknikler bize eritrosit microRNA düzensiz düzeyleri orak eritrositlerin hücre içsel sıtma direncine katkıda bulunduğunu göstermek için izin verdi.
Introduction
Cinsi Plasmodium apicomplexan parazitlerin neden Sıtma, Her yıl dünya çapında yaklaşık 200 milyon kişiyi enfekte ve yaklaşık 600.000 kişinin ölümüne neden olan 1, en yaygın insan parazitik bir hastalıktır. İnsanları enfekte eden beş Plasmodium türleri arasında, insan hastalığı ile en çok ilgili P. ve P. falciparum Şiddetli sıtma komplikasyonlar için onların yaygın dağılımları ve potansiyel nedeniyle Vivax. Sıtma parazitinin yaşam döngüsü sivrisinekler ve insanlarda hem de enfeksiyon gerektirir. Virüslü bir sivrisinek bir insanı ısırdığında, parazitler replikasyon başlangıç yuvarlak meydana karaciğer, kan dolaşımı yoluyla seyahat. Ev sahibi hepatosit gelen merozoitler kopma sonra, aseksüel veya cinsel ya çoğaltma başlatarak, yakındaki kırmızı kan hücreleri enfekte. P. 48 saat sürer replikasyon aseksüel aşaması, en mal kaynağı hem beri falciparum, bu çalışmanın odak noktasıaria semptom ve kolayca in vitro değinmeyecek.
Gelişmiş anti-sıtma terapileri de dahil olmak üzere kamu sağlığı girişimlerinin, bir dizi biraz küresel sıtma yükünü azalttık ederken, ilaca dirençli parazitlerin devam çıkması sıtma kontrolü çabaları için bir sorun oluşturur. Yeni tedavi yaklaşımları önerebilir bir alan genetik varyantlar sıtmaya karşı direnç kazandıran nasıl çeşitli üzerinde çalışmadır. Sıtmanın endemik olduğu bölgelerde, eritrosit polimorfizmleri çeşitli 2,3 oldukça yaygındır. Orak hücre belki de en belirgin olduğu bu mutasyonlar, semptomatik sıtma enfeksiyonu 4 başlamasından büyük bir direnç ile ilişkilidir. Onlar sıtma enfeksiyonu karşı eritrositler nedeni olan altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Hemoglobin mutasyonları ile parazitlenmiş eritrositler gelişmiş hücresel katılık ve dehidratasyon yoluyla geliştirilmiş fagositoz tabi olanP. azalarak işgali ile ilişkili 5 Falciparum. HbS, HbC allelin de eritrosit yüzeyine ve hücre iskeleti yeniden modellenmesi, daha da parazit gelişimini inhibe 6,7 protein ekspresyonunu etkilemektedir. Son olarak, P. Falciparum homozigot orak içinde kötü büyür (HbSS) sıtma direnci içsel faktörler eritrosit düşündüren, in vitro 8,9 eritrosit. Bu mekanizmaların her bir rol oynuyor gibi görünmektedir Ancak, tam sıtma orak hücre direnci arkasında mekanizmalarını açıklar yoktur.
Yeterince anlaşılamamıştır eritrosit faktörlerden biri potansiyel seti olgun eritrositler içinde miRNA mevcut büyük havuzudur. MikroRNA'lar 3 'UTR içindeki baz çiftlemesi, çeviri ve / veya hedef mRNA stabilitesini aracılık 19-25 nt küçük boyutlu kodlayıcı olmayan RNA'lar, bulunmaktadır. Bu bastırma-o dahil olmak üzere, memeli bağışıklık tepkilerinin kontrolünde implike edilmiştirf virüs replikasyonu, 10, ve bitkilerde virüslere karşı direnç gösterilmiştir Ayrıca eritropoezi 11,12 ve demir metabolizması 13 dahil olmak üzere birçok eritrosit süreçleri düzenleyen gösterilmiştir. Önceki çalışmalar ifadesi dramatik HBSS değiştirilmiş 14,15 eritrosit eritrosit miRNA'lar, bir bol ve çeşitli nüfus tespit edilmiştir. Olgun eritrositler aktif transkripsiyon ve çeviri yoksun olduğundan, bu eritrosit miRNA'lar fonksiyonel rolü belirsizliğini korumaktadır. Önemli malzeme değişimi konak hücreye ve P. arasında oluşur gibi intraerythrocytic gelişim döngüsü (IDC) 16 sırasında falciparum, bu HbS eritrositler içinde değişmiş miRNA profil doğrudan hücre içsel sıtma direncine katkıda bulunabilir iddia edildi.
Bu çalışmalar sonunda, izole tespit ve fonksiyonel m olan, insan miRNA'nın rolünü araştırmak için bir boru hattı geliştirilmesine yol açmıştıralaria parazit P. Bu konak / insan miRNA'lar sonuçta kovalent sigorta ve sonra translasyon parazit mRNA transkriptleri 17 bastırmak olduğunu belirtti falciparum. Bu şekilde trans-ekleme ile oluşturulan ilk çapraz tür kimerik transkript bir örnek Resim ve miRNA mRNA füzyon diğer parazitler gibi diğer türlerde de meydana geliyor olabilir bir şekilde gösterir. Tüm tripanosom mRNAlar trans-splayslanmış bir bağlayıcı lideri (SL) ile polisistronik transkript 18 ayrılmasını düzenleyen bulunmaktadır. P. yana falciparum Dicer / Önce 19,20 için ortologlarını yoksun, bu eritrosit miRNA'lar P. benzer SL makineleri kaçırmak mümkündür falsiparum hedef genlerin entegre. P. Son çalışmalar falsiparum Aslında 5 'lider sekansların bağlantı 21 mevcudiyetine işaret vardır. Bu çalışma transkriptomik ve transla de dahil olmak, insan-parazit miRNA-mRNA füzyon transkriptleri keşfine yol açtı yöntemleri ayrıntılarıtional regülasyon teknikleri. Bu yöntemlerin genel amaçları P. gen regülasyonu, fenotipleri ve çeviri potansiyelinin küçük RNA'ların etkilerini araştırmak için vardır Falciparum transkript.
İnsan-parazit kimerik transkript ilk tanımlama gibi oldukça sadece küçük RNA'lar izole teknikleri kullanarak daha toplam hem de küçük RNA'lar dahil real-time PCR, transcriptome sıralama ve EST kütüphane yakalama gibi RNA analiz tekniklerinin kullanımı üzerine dayanıyordu. Büyük bir havuzda birlikte tüm RNA İzolasyon, ayrı ayrı olarak daha parazit hem transloke insan küçük RNA belirlenmesini yanı sıra daha büyük bir sekansın bir parçası olarak, bu küçük bir RNA dizilerinin varlığının sağladı. Bu daha sonra bu füzyonların fonksiyonel sonuçlarını belirlemek için bu füzyon mRNA'ların çeviri devletin bir analizini gerekli.
Parazitin genom bir karakterizasyonu kapsamlı çabalar ikend transcriptome parazitin biyoloji 22-25 anlayışına eklemiş, çok daha az P. yaşam döngüsü boyunca mRNA transcriptome öteleme yönetmelik hakkında bilinen Falciparum 26. Parazitin proteom Bu sınırlı anlayış parazitin biyoloji anlayışını ve anti-sıtma terapötik nesil için yeni hedefler belirlemek için yeteneği hem de engellemiştir. Parazitin hücre biyolojisi anlayış bu boşluk P. translasyonel düzenlemeyi incelemek için yeterli tekniklerin olmaması nedeniyle büyük ölçüde devam etmiştir Falciparum. Yakın zamanda kağıt P. ribozomal ayak izi kullanımını tarif Falciparum küresel çeviri durumunu belirlemek için 21. Transkript öteleme potansiyelinin biri iyi kurulmuş ölçüm Polizom profilleme tarafından belirlenen ilgili ribozomların sayısıdır. Bununla birlikte, ne bu teknik, P. uygulanır Falciparum </ em>, en Polisomlar kurtarmak edemiyor ve ağırlıklı olarak monosomes yakalar. Son zamanlarda, çeşitli gruplar 27,28 P. optimize Polisomlar korumak ve ev sahibi kırmızı hücrelerin 28 kendi aseksüel gelişimi sırasında bu sıtma parazitlerinin ribozomal doluluk ve translasyonel potansiyelini karakterize etmek aynı zamanda eritrosit ve parazit parçalama yoluyla falsiparum Polizom teknikleri.
Topluca, bu yöntemler, insan miRNA ve parazit mRNA'larının gözlenen füzyon daha önce bildirilen yöntemler kullanılarak 27 gösterilmiştir olanlar füzyon mRNA'lann, parazit protein çevirisini modüle ve HBA sıtma direncinin önemli bir belirleyicisidir ve HbSS 17 eritrosit göstermektedir. Bu yöntemler, bu füzyon RNA'lar P. içinde olup olmadığını, RNA ekleme olaylarını tanımlamak ve fonksiyonel keşfetmek isteyen herhangi bir sisteme yararlı olacaktır falciparum ya da olmasın diğer ökaryotik sistemlerde.
Protocol
Representative Results
Discussion
HbS o P. neden olduğu şiddetli sıtmaya karşı koruma sağlar, çünkü büyük ölçüde, sıtmanın endemik bölgelerde en yaygın hemoglobin varyantları biridir Falciparum. Teknikleri P. gen regülasyonu insan microRNA rolünü karakterize etmek gerekli Falciparum Bu yazının boyunca ayrıntılı olarak verilmektedir. Tüm küçük RNA'ların içerecek şekilde toplam RNA ekstre edilmesi ve oldukça basit bir parazit lizis prosedürü uygulayarak olarak, bu füzyon RNA'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, Duke Chancellor’s pilot project fund, the Roche Foundation for Anemia Research and The Bill and Melinda Gates Foundation. G.L. is supported by Duke’s UPGG and the NIH (Grant # 5R01AI090141-03) and K.A.W. by the NSF Graduate Research Fellowship Program.
Materials
| REAGENTS-All reagents must be RNAse-free. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758) |
| DEPC-treated water (see REAGENT SETUP) |
| Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher) |
| Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad) |
| 0.2 cm Electroporation cuvettes |
| 4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700) |
| 2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527) |
| 1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545) |
| 1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000) |
| 100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626) |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021) |
| 10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750) |
| Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698) |
| Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04) |
| RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840) |
| RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV) |
| 10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039) |
| Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060)) |
| HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030) |
| 45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769) |
| 1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080) |
| 1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV) |
| Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769) |
| Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702) |
| Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01) |
| mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific). |
| 5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon) |
| Biotin powder (Sigma-Aldrich) |
| 1M Potassium Chloride |
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare) |
| Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP) |
| Lysis buffer (see REAGENT SETUP) |
| 15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP) |
| 50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP) |
| 0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP) |
| 60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP) |
| Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP) |
| RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP) |
| RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP) |
| REAGENT SETUP |
| Solutions |
| Plasmodium cell culture media |
| 500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine |
| 0.5 ml gentamicin |
| 5 ml HT supplement |
| 2.5 ml 45% glucose |
| 25 ml 10% AlbuMAX I |
| 12.5 ml 1 M HEPES |
| Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask. |
| Plasmodium cell culture media containing 10x CHX |
| Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of: |
| 2 mM cycloheximide |
| Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter. |
| 1x PBS containing cycloheximide |
| Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use. |
| Ribosome resuspension buffer |
| 400 mM potassium acetate |
| 25 mM potassium HEPES, pH 7.2 |
| 15 mM magnesium acetate |
| 200 mM cycloheximide (add fresh) |
| 1 mM DTT (add fresh) |
| 1 mM PMSF (add fresh) |
| 40 U/ml RNaseOUT (add fresh) |
| Lysis buffer |
| Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of: |
| 1% (v/v) Igepal CA-630 |
| 0.5% (w/v) DOC |
| Sucrose solutions |
| Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose: |
| 15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution |
| 50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution |
| 0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion |
| As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh. |
| The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components |
| 60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution |
| RNA Capture Wash Buffer |
| 20mM KCl |
| 5unit/ml Rnase Out (Invitrogen) |
| RNA Capture Elution Buffer |
| Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of: |
| 2mM Biotin |
| EQUIPMENT |
| SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194) |
| SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362) |
| Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057) |
| Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372) |
| L8-80M ultracentrifuge (Beckman) |
| Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378) |
| 1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623) |
| 5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646) |
| Parafilm |
| Tube rotator, end-over-end |
| Microcentrifuge, refrigerated |
| Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179) |
| TracerDAQ (Measurement Computing) |
| Eppendorf 5810R centrifuge |
| Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807) |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2014).
- Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
- Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
- Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
- Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
- Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
- Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
- Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
- Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
- Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
- Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
- Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
- Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
- Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408 (2013).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360 (2008).
- Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
- Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
- Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
- Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
- Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
- Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
- Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108 (2012).
- Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
- Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5 (2003).
- Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
- Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
- Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128 (2013).
- LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
- Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
- Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
- Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
- Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
- Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47 (2008).
