Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em> Plasmodium falciparum</em
Summary
Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.
Abstract
La variación genética responsable para el alelo de células falciformes (HbS) permite a los eritrocitos para resistir la infección por el parásito de la malaria, P. falciparum. La base molecular de esta resistencia, que se sabe que es multifactorial, sigue siendo incompleta entendido. Estudios recientes han encontrado que la expresión diferencial de microRNAs de eritrocitos, una vez trasladadas en parásitos de la malaria, afectan tanto a la regulación de genes y el crecimiento del parásito. Estos miRNAs se muestran más adelante para inhibir la traducción del ARNm mediante la formación de un transcrito de ARN quimérico a través de 5 'de fusión de ARN con subconjuntos discretos de mRNAs de parásitos. Aquí, las técnicas que se utilizaron para estudiar el papel funcional y la posible existencia de mecanismo microRNAs eritrocitos subyacentes en la regulación de genes y el potencial de la traducción de P. falciparum, incluyendo la transfección de microRNAs sintéticos modificados en los eritrocitos de acogida, se detallará. Finalmente, un método de gradiente de polisomas se utiliza para determinar la extensión de translation de estas transcripciones. En conjunto, estas técnicas nos han permitido demostrar que los niveles de microARN dysregulated eritrocitos contribuyen a la resistencia a la malaria de células intrínseca de los eritrocitos falciformes.
Introduction
La malaria, causada por parásitos apicomplexan del género Plasmodium, es la enfermedad parasitaria humana más común, infectando a nivel mundial unos 200 millones de personas cada año y causa alrededor de 600.000 muertes 1. De las cinco especies de Plasmodium que infectan a los seres humanos, los más relevantes para las enfermedades humanas son P. falciparum y P. vivax, debido a sus distribuciones generalizadas y el potencial de complicaciones graves de malaria. El ciclo de vida del parásito de la malaria requiere la infección de ambos mosquitos y seres humanos. Cuando un mosquito infectado pica a un humano, los parásitos viajan a través del torrente sanguíneo hasta el hígado, donde se produce una ronda inicial de la replicación. Después de merozoitos ruptura del hepatocito anfitrión, que infectan los glóbulos rojos cercanos, iniciando la replicación sea asexual o sexual. La etapa asexual de replicación, que tiene una duración de 48 horas en P. falciparum, es el foco de este estudio, ya que es a la vez la fuente de la mayoría malsíntomas aria y se recapitulan fácilmente in vitro.
Si bien una serie de iniciativas de salud pública, incluyendo la mejora de los tratamientos contra la malaria, han reducido un poco la carga de la malaria a nivel mundial, la continua aparición de parásitos resistentes a los fármacos presenta un problema para los esfuerzos de control de la malaria. Una de las áreas que pueden sugerir nuevos enfoques terapéuticos es el estudio de cómo las diversas variantes genéticas confieren resistencia a la malaria. En las regiones donde la malaria es endémica, una variedad de polimorfismos eritrocitarios son bastante comunes 2,3. Estas mutaciones, con células falciformes siendo quizás el más destacado, a menudo se asocian con la resistencia sustancial a la aparición de la infección de la malaria sintomática 4. Los mecanismos subyacentes por los que causan los eritrocitos para resistir la infección por malaria se conocen por completo. Eritrocitos parasitados con mutaciones de hemoglobina están sujetos a una mayor fagocitosis través rigidez celular mejorada y deshidratación, queestá asociada con la invasión disminuido en P. falciparum 5. El alelo HbC también afecta a la expresión de proteínas en la superficie de los eritrocitos y con la remodelación del citoesqueleto, inhibiendo aún más el desarrollo del parásito 6,7. Por último, P. falciparum crece mal dentro falciformes homocigóticos (HBSS) eritrocitos 8,9 in vitro, lo que sugiere factores eritrocitarios intrínsecas de resistencia a la malaria. Sin embargo, aunque todos estos mecanismos parecen jugar un papel, no explican plenamente los mecanismos detrás de la resistencia de células falciformes a la malaria.
Un conjunto potencial de los factores eritrocitarios que permanecen poco conocida es la gran reserva de miARN presentes dentro de los eritrocitos maduros. Los microARNs son pequeños RNAs no codificantes, 19-25 de nt en tamaño, que median la traducción y / o estabilidad del ARNm diana por emparejamiento de bases dentro de la 3 'UTR. Ellos han sido implicados en el control de la respuesta inmune de mamíferos, incluyendo el o supresiónla replicación del virus f 10, y fueron demostrado que confieren resistencia a virus en plantas Ellos también se han demostrado que regulan varios procesos eritrocitarios, incluyendo la eritropoyesis 11,12 y metabolismo del hierro 13. Estudios previos identificaron una población abundante y diversa de miRNAs eritrocítica, cuya expresión se alteró dramáticamente en HbSS eritrocitos 14,15. Puesto que los eritrocitos maduros carecen de la transcripción y la traducción activa, el papel funcional de estos miRNAs eritrocitos sigue siendo poco clara. Como se produce el intercambio de material significativa entre la célula huésped y P. falciparum durante el ciclo de desarrollo intraeritrocitaria (IDC) 16, se especuló que el perfil de miARN alterado dentro de los eritrocitos HbS puede contribuir directamente a la resistencia a la malaria de células intrínseca.
Estos estudios condujeron en última instancia al desarrollo de una tubería para aislar, identificar y funcionalmente estudiar el papel de los genes miARN humano dentro de la mparásito alaria, P. falciparum, que indicaron que los anfitriones / miRNAs humanos en última instancia, de forma covalente de fusibles y luego reprimir traslación transcripciones de ARNm parásito 17. Esto proporcionó un ejemplo de las primeras especies cruzadas transcripciones quiméricos formados por trans-empalme e implica que esta fusión miARN-mRNA podría estar ocurriendo en otras especies, incluyendo otros parásitos. Todos los ARNm tripanosoma son trans-empalmados con un empalme-líder (SL) para regular la separación de polycistronic transcripciones 18. Desde P. falciparum carece ortólogos para Dicer / Ago 19,20, es posible que los miRNAs eritrocitos secuestran SL maquinaria similar en P. falciparum para integrar en los genes diana. Estudios recientes en P. falciparum tiene, de hecho, indica la presencia de secuencias líder 5 'de empalme 21. Este estudio detalla los métodos que llevaron al descubrimiento de transcripciones de fusión-humanos parásito miARN-mRNA, incluyendo tanto transcriptómica y translatécnicas de regulación cionales. Los objetivos generales de estos métodos son para investigar los efectos de los pequeños RNAs en la regulación de genes, fenotipos y traducción potencial de P. transcripciones falciparum.
La identificación inicial de los transcritos quiméricos humanos parásito se basó en el uso de técnicas de análisis de ARN, tales como PCR en tiempo real, la secuenciación del transcriptoma y EST captura de biblioteca, que incluía tanto totales y pequeños RNAs, en lugar de utilizar técnicas que sólo aislados pequeños RNAs. Aislamiento de RNA todos juntos en una piscina grande, en lugar de por separado, permitió la identificación de ambos translocados pequeños RNAs humanos en el parásito, así como la presencia de estas pequeñas secuencias de ARN como parte de una secuencia más grande. Esto entonces requiere un análisis del estado traducción de estos mRNAs de fusión para determinar las consecuencias funcionales de estas fusiones.
Mientras que los grandes esfuerzos en la caracterización de un genoma del parásitod transcriptoma han añadido a la comprensión de la biología del parásito 22-25, mucho menos se sabe acerca de la regulación de la traducción del ARNm transcriptoma en todo el ciclo de vida de P. falciparum 26. Esta comprensión limitada del proteoma del parásito ha dificultado tanto la comprensión de la biología del parásito y la capacidad de identificar nuevos objetivos para la próxima generación de terapias contra la malaria. Esta brecha en la comprensión de la biología celular del parásito ha persistido en gran parte debido a la falta de técnicas adecuadas para investigar la regulación de traducción en P. falciparum. Un artículo reciente describe el uso de la huella ribosomal de P. falciparum para determinar el estado de la traducción mundial 21. Una medida bien establecida de potencial de traslación de las transcripciones es el número de ribosomas asociados determinados por polisomas perfilado. Sin embargo, cuando se aplica esta técnica para P. falciparum </ em>, no es capaz de recuperar la mayoría de los polisomas y captura predominantemente monosomas. Recientemente, varios grupos han optimizado 27,28 P. técnicas polysome falciparum por lisis de los eritrocitos y parásitos simultáneamente para preservar los polisomas y caracterizar la ocupación ribosomal y el potencial de la traducción de estos parásitos de la malaria durante su desarrollo asexual en las células rojas de acogida 28.
Colectivamente, estos métodos demuestran que la fusión observado de mRNAs miARN y parásitos humanos modula la traducción de proteínas del parásito de esos mRNAs de fusión, que se demostró utilizando métodos reportados previamente 27, y es un importante factor determinante de la resistencia a la malaria en HbAS y HbSS eritrocitos 17. Estos métodos podrían ser útiles en cualquier sistema en busca de identificar y funcionalmente explorar eventos de empalme de ARN, ya se trate de los ARN de fusión están a P. falciparum u otros sistemas eucariotas.
Protocol
Representative Results
Discussion
HbS es una de las variantes de hemoglobina más comunes en las zonas endémicas de malaria, en gran medida, ya que proporciona protección contra la malaria grave por P. falciparum. Las técnicas necesarias para caracterizar el papel del microRNA humana en la regulación de genes de P. falciparum se detallan a lo largo de este manuscrito. Mediante la extracción de ARN total de una manera tal como para incluir todos los pequeños RNAs, y mediante la realización de un procedimiento de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, Duke Chancellor’s pilot project fund, the Roche Foundation for Anemia Research and The Bill and Melinda Gates Foundation. G.L. is supported by Duke’s UPGG and the NIH (Grant # 5R01AI090141-03) and K.A.W. by the NSF Graduate Research Fellowship Program.
Materials
| REAGENTS-All reagents must be RNAse-free. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758) |
| DEPC-treated water (see REAGENT SETUP) |
| Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher) |
| Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad) |
| 0.2 cm Electroporation cuvettes |
| 4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700) |
| 2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527) |
| 1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545) |
| 1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000) |
| 100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626) |
| 10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021) |
| 10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750) |
| Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698) |
| Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04) |
| RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840) |
| RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV) |
| 10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039) |
| Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060)) |
| HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030) |
| 45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769) |
| 1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080) |
| 1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV) |
| Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769) |
| Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702) |
| Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01) |
| mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific). |
| 5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon) |
| Biotin powder (Sigma-Aldrich) |
| 1M Potassium Chloride |
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare) |
| Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP) |
| Lysis buffer (see REAGENT SETUP) |
| 15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP) |
| 50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP) |
| 0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP) |
| 60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP) |
| Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP) |
| RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP) |
| RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP) |
| REAGENT SETUP |
| Solutions |
| Plasmodium cell culture media |
| 500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine |
| 0.5 ml gentamicin |
| 5 ml HT supplement |
| 2.5 ml 45% glucose |
| 25 ml 10% AlbuMAX I |
| 12.5 ml 1 M HEPES |
| Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask. |
| Plasmodium cell culture media containing 10x CHX |
| Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of: |
| 2 mM cycloheximide |
| Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter. |
| 1x PBS containing cycloheximide |
| Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use. |
| Ribosome resuspension buffer |
| 400 mM potassium acetate |
| 25 mM potassium HEPES, pH 7.2 |
| 15 mM magnesium acetate |
| 200 mM cycloheximide (add fresh) |
| 1 mM DTT (add fresh) |
| 1 mM PMSF (add fresh) |
| 40 U/ml RNaseOUT (add fresh) |
| Lysis buffer |
| Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of: |
| 1% (v/v) Igepal CA-630 |
| 0.5% (w/v) DOC |
| Sucrose solutions |
| Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose: |
| 15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution |
| 50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution |
| 0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion |
| As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh. |
| The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components |
| 60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution |
| RNA Capture Wash Buffer |
| 20mM KCl |
| 5unit/ml Rnase Out (Invitrogen) |
| RNA Capture Elution Buffer |
| Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of: |
| 2mM Biotin |
| EQUIPMENT |
| SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194) |
| SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362) |
| Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057) |
| Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372) |
| L8-80M ultracentrifuge (Beckman) |
| Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378) |
| 1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623) |
| 5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646) |
| Parafilm |
| Tube rotator, end-over-end |
| Microcentrifuge, refrigerated |
| Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179) |
| TracerDAQ (Measurement Computing) |
| Eppendorf 5810R centrifuge |
| Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807) |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2014).
- Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
- Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
- Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
- Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
- Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
- Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
- Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
- Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
- Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
- Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
- Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
- Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
- Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408 (2013).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360 (2008).
- Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
- Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
- Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
- Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
- Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
- Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
- Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108 (2012).
- Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
- Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5 (2003).
- Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
- Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
- Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128 (2013).
- LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
- Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
- Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
- Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
- Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
- Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47 (2008).
