JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Subcutane Angiotensine II infusie met behulp van osmotische pompen induceert aorta-aneurysma's in Muizen

Published: September 28, 2015
doi:
10.3791/53191
, , , , , ,
1Saha Cardiovascular Research Center,University of Kentucky, 2Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky

Summary

Onderhuidse implantatie van osmotische pompen biedt een handige aanpak voor langdurige en consistente levering van verbindingen. Deze benadering is uitgebreid gebruikt voor zowel abdominale en thoracale aorta aneurysma's in muizen te bestuderen.

Abstract

Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 – 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.

Introduction

Aorta-aneurysma's vertonen permanente luminal uitbreiding van de aorta die breuk voorspelt en meestal leidt tot de dood. Deze ziekte komt zowel abdominale en thoracale aorta's, die worden aangeduid als abdominale aorta aneurysma (AAA) en thoracale aorta aneurysma's (TAA's), respectievelijk. Als gevolg van een onvolledig begrijpen van de moleculaire mechanismen en pathofysiologische processen, is er geen bewezen medische therapie die uitzetting of breuk van elk type aorta aneurysma kan voorkomen. Omdat het moeilijk is om patiëntenmonsters verwerven en experimenten bij mensen direct onderzoek gericht op het definiëren van mechanismen van AAA is herhaaldelijk geëxtrapoleerd uit diermodellen. Een veelgebruikt diermodel subcutaan infuus van angiotensine II (Ang II) in muizen. In vergelijking met andere chirurgische benaderingen voor het induceren AAAs bij muizen, zoals intra-aorta elastase perfusie of peri-aorta toepassing van calciumchloride die vereisen laparotomie 1,2 Deze method niet binnenkomst in de lichaamsholte vereist en vereist een minimale chirurgische deskundigheid 3,4.

Subcutane infusie van Angll osmotische pompen AAAs induceren eerste instantie in low density lipoproteïne (LDL) receptor – / – muizen die een verzadigd vet verrijkte dieet 3 en vervolgens in apoE – / – muizen die normaal laboratorium voeding 4. Veel recente studies hebben ook aangetoond dat AngII induceert AAAs in normolipidemische muizen 5-7. De aanpak van infusie AngII is toegepast op AAAs induceren en staand moleculaire mechanismen en voor de ontwikkeling van mogelijke therapeutische strategieën (bijvoorbeeld 5-15) aangezien dit model recapituleert veel functies waargenomen in menselijke AAA. Bijvoorbeeld, de risicofactoren van menselijke AAAs zoals roken, veroudering, en mannelijk geslacht ook vergroten Angll geïnduceerde AAAs in muizen 16,17. De associatie van hypercholesterolemie met AAAs bij de mens vraagt ​​verduidelijking. Het heeft echter zijnen logisch dat hypercholesterolemie verhoogt AngII geïnduceerde AAAs bij muizen 18. Pathologieën van Angll geïnduceerde AAAs in muizen zijn zeer heterogeen en worden gekenmerkt door diepe macrofaag infiltratie, collageenafbraak, trombotische vorming en de resolutie, en neovascularisatie 19-21. In tegenstelling tot de meest voorkomende infrarenale aorta locatie van AAAs bij de mens, AngII geïnduceerde AAAs bij muizen voorkomen in het suprarenale aorta regio. Een ander kenmerk van Angll alomtegenwoordig geïnduceerde AAA is de transmurale mediale breken, wat leidt tot transmurale trombose. Het is onduidelijk of transmuraal elastine breuk optreedt bij de mens sinds pathologische ontwikkeling van AAAs bij mensen is niet uitsluitend onderzocht door een gebrek aan aneurysma weefsel van eerdere stadia.

Angll infusie in muizen leidt tot diepgaande expansie van de thoracale aorta gebied, dat voornamelijk beperkt is tot de omhooggaande aorta, de meest voorkomende regio TAA bij de mens <sup> 19,22-26. Vergelijkbaar met Angll geïnduceerde AAAs, TAA veroorzaakte tijdens Angll infusie ook recapituleren vele functies van het menselijk TAA's 25. Echter, in tegenstelling tot AngII geïnduceerde AAAs, AngII geïnduceerde TAA's zijn niet geassocieerd met hypercholesterolemie en hebben genderverschillen hebben.

De algemene doelstelling van subcutane Angll infusie in muizen is om pathologische kenmerken en moleculaire mechanismen van AAA en TAA's te bestuderen.

Protocol

Ethiek Verklaring: Muis studies worden uitgevoerd met toestemming van de Universiteit van Kentucky Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC protocol nummer: 2006-0009). Muizen worden gedood op beëindiging middels een overdosis cocktail van ketamine (~ 210 mg / kg) en xylazine (~ 30 mg / kg). 1. Berekening van Angll Bedrag Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van het voorbeeld van infusie van Angll (1000 ng / kg / min) gedurende 4 weken in 4 male LDL receptor – / – muizen die een verzadigd vet verrijkte dieet. Weeg studeren muizen voordat de berekening van Angll nodig voor infusie. Met de sjabloon (Tabel 1) om het Angll massa die nodig is voor het experiment berekenen. Gebruik de "Mean pompsnelheid" vermeld in de instructiehandleiding van pompen als de "pompsnelheid" in stap 4 van de template. In de sjabloon, opnemen stappen 1-5 met de hand, en Stappen 6-10 worden automatisch berekend. In de sjabloon wordt aangenomen datmuizen 1 g lichaamsgewicht tijdens infusie van Angll 1000 ng / kg / min gedurende 4 weken. OPMERKING: Elke muis kan heel verschillend lichaamsgewicht die afhankelijk is van vele variabelen, zoals muizenstam en dieet. We routinematig gebruik van "0" of "1 g" op basis van onze eigen ervaring uit eerdere studies. Bereken een 300 ul totaal volume van Angll oplossing voor elke muis aangezien elke pomp is ongeveer 250 ul. 2. Ontbinding van Angll WINKEL gevriesdroogd Angll flesjes bij -20 ° C. Evenwicht Angll flacons tot kamertemperatuur vóór opening. Weeg de berekende massa Angll (7,3 mg zie tabel 1) in een steriele plastic buis. OPMERKING: Per Merck Index, geen glazen buizen gebruikt voor het oplossen aangezien een waterige oplossing van Angll heeft een sterke affiniteit voor binding aan glas. Voeg de berekende volume van steriele zoutoplossing (1200 μl) in de kunststof buis met het gevriesdroogde Angll, kap en meng goed door omkering totdat de oplossing helder is. Label muis getallen # 1, # 2, # 3 en # 4 individuele steriele plastic buizen met doppen (0,5 – 1,5 ml). Bereid Angll oplossing onder een laminaire kap voor elke muis basis van het lichaamsgewicht, berekend in stap 1.2 en Tabel 1. Bijvoorbeeld, pipet 3,6 ul steriele zoutoplossing in de buis # 1, dan 296,4 ul Angll oplossing, en meng goed door en neer te pipetteren voorzichtig. Etiket muis nummers op plastic buizen met doppen (4 ml; steriel). Deze zullen worden gebruikt voor de incubatie pompen zoals beschreven in stap 3.13. 3. osmotische pomp Vullen Verkrijgen pompen in twee afzonderlijke delen: het hoofdlichaam van de pomp en de stromingsmoderator (figuur 1). Elke doos heeft 10 pomp organen en stroom moderators die individueel zijn verpakt. Noteer het lotnummer. NB: Draag altijdHandschoenen omdat olie overgebracht van handen om de buitenmantel van de pomp nadelig beïnvloeden pompfunctie. Gebruik steriele handschoenen, gaas, buizen, het vullen van de naald, en wegen boten om de pompen te bereiden, om het risico van besmetting van het implantaat te voorkomen. Open alleen het aantal pomp organen en stroom moderators nodig zijn voor het onderzoek, omdat deze niet kan worden opgeslagen eenmaal geopend. Als er meer dan 10 pompen nodig zijn, ervoor zorgen dat de lotnummers van de pompen zijn dezelfde voor een studie, omdat pompen van verschillende lotnummers hebben verschillende Mean Fill Volume en pompsnelheid. Weeg elke pomp (met inbegrip van zowel het belangrijkste lichaam en flow moderator), en noteer het gewicht tot 4 decimalen (bijvoorbeeld 1,1443 g muis # 1). Dit gewicht, aangeduid als "Pump gewicht leeg" in de template (Tabel 1), zullen worden gebruikt om de gevulde verhouding berekenen. Bevestig de pomp vullen naald om een ​​1 cc steriele spuit en voorzichtig vul de spuit met Angll oplossing uit de juiste wijzegenummerde plastic buis. Het is belangrijk te voorkomen dat er lucht in de injectiespuit. Verwijder alle luchtbellen zorgvuldig uit de spuit, terwijl de naald naar beneden wordt geplaatst. Houd de naald / spuit in deze positie om de introductie van luchtbellen in de pomp te voorkomen. Steek voorzichtig de vulling naald in het pomphuis. Schuif de punt van de naald in de pomp. Rust niet de punt van de naald stevig op de bodem van de pomp. Duw de zuiger langzaam naar de pomp met Angll oplossing te vullen. Een donkere schaduw in de pomp geeft de vulling niveau. Het vulvolume bedraagt ​​ongeveer 246 ui per instructies. Stoppen met het vullen van de pomp en verwijder de naald zodra een kraal van de vloeistof stijgt uit de pomp. Plaats stromingsmoderator in de pomp door het gat boven op pomplichaam tot geen ruimte gezien tussen de kop van de stromingsmoderator en de bovenkant van het pomphuis (figuur 1). Inbrengen van moderatof in het pomphuis leidt tot enige vloeistof uit de opening van de stromingsmoderator. Vlek alle extra vloeistof die tijdens de plaatsing van de beheerders zouden hebben gelekt zorgvuldig. Weeg gevulde pomp. Registreer het gewicht onder "Pump Gewicht gevuld" in de sjabloon. Bereken Vullen Ratio (%) = (Pump Gewicht "gevuld" – "lege") x 1000 / betekenen vullen volume x 100. Bereken vullingsgraad zoals aangegeven in tabel 1. Idealiter vullingsgraad moet gelijk of groter dan 100% bedragen. Vulling pomp als de vullingsgraad is <95% (wat impliceert dat luchtbellen kunnen aanwezig zijn in de pomp zijn). Plaats de gevulde pomp in de gemerkte 4 ml buis (Stap 2.5) met de moderator hoofd naar boven. Voeg voldoende hoeveelheid steriele zoutoplossing om de pomp dekken. Houd de pomp in de buis van zoutoplossing tot de implantatie. Plaats buisjes in een 37 ° C incubator. Incubate pompen O / N (minimaal 12 uur) partiële priming staan ​​en vervolgens implanteren in muizen. Pomping van Angll begint ongeveer 24 uur na implantatie, waardoor muizen herstellen van een operatie vóór eventuele spanning die tijdens Angll infusie. 4. Voorbereiding voor Pump Implantatie Autoclaaf (zwaartekracht modus, droge cyclus, 15 min) gaas, wattenstaafjes en chirurgische instrumenten, waaronder een schaar, hemostat, tang, nietjes en nietmachine ten minste 1 dag voorafgaand aan de operatie. In een procedure kamer, voor te bereiden verdamper voor anesthesie met isofluraan. Openstellen steriele doeken in een laminaire stroming kap, en plaats neuskegel voor isofluraananesthesie. Plaats betadine, 70% ethanol, steriel water, kraal sterilisator, antiseptische handrub, wattenstaafjes, gaas, en gevuld pompen in een laminaire kap. Don een masker en toga, open vervolgens een buitenste laken in een laminaire kap met schone handen. Trek steriele handschoenen en open de steriele verpakking binnen. 5. Chirurgische Procedure van Pump Implantatie Plaats de muis in een inductie Chamber met instroom isofluraan bij een stroomsnelheid van 1,5 – 2%. Controleer de muis tegen 2 – 3 min na decubitus. Scheren een gebied ter grootte van een kwart, over de linker of rechter schouder. Plaats de muis in een laminaire kap, met zijn neus vlak met een kegel verbonden isofluraan uitstroom (Figuur 2A). Plaats het hoofd van de muis in de richting van dominante hand van de chirurg. Gebruik vet zalf op de ogen muis tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Controleer of de muis geen respons op stimulatie van de pijn voor chirurgie. Bijvoorbeeld, pedaalrespons is een goede indicator voor pijn. Wattenstaafje en veeg geschoren met betadine, gevolgd door drie doekjes met 70% ethanol. Don of wijzigen steriele handschoenen. Gebruik een chirurgische scalpel op een ~ 1 cm incisie achter het oor over het schouderblad van de voorpoot te maken. Deze incisie moet loodrecht op de staart. Wees voorzichtig om alleen de huid en niet de onderliggende weefsels te snijden. Hold krachteeps één kant open incisie, en met de andere hand een subcutane tunnel te maken onder de huid met een hemostaat (figuur 2B). Advance hemostaat tip in de richting van de staart, en een zak voor de pomp. Dit wordt bereikt door voorzichtig openen van de kaken van de hemostaat onder de huid te openen een zakje. Trek de hemostaat van incisie. Plaats pomp in de incisie met de moderator kop gepositioneerd aan de achterzijde van de muis (Figuur 2C). Duw de pomp volledig in de zak. Er moet voldoende ruimte om de wond te sluiten zonder spanning of uitrekking van de huid. Zodra een pomp is geplaatst, stevig knijpen beide zijden van de incisie, het strekken zodat de randen ontmoeten en plaats 1 of 2 wondklemmen te sluiten (figuur 2D). Inspecteer de incisieplaats te zorgen voor volledige sluiting van de wond, en dat de pomp niet direct drukken op het terrein. Solliciteer actuele lidocaïne crème(4% w / w) met een schone katoenen swab.Remove muis uit de neuskegel, en plaats deze op een verwarmingselement tot het weer bij bewustzijn. Na het winnen, wordt de muis teruggebracht naar zijn kooi. Plaats chirurgische instrumenten in een kraal sterilisator gedurende 10 seconden tussen de muizen. Sta instrumenten afkoelen voor gebruik. Schone handschoenen met een antiseptische handrub tussen muizen. Monitor alle muizen tot volledig herstel is bereikt. Monitor muizen worden kort na de operatie. Injecteren van een bolus van steriele zoutoplossing (0,2-0,3 ml) subcutaan als een muis toont tekenen van angst, uitdroging of schijnbare gewichtsverlies. Observeren muizen ten minste tweemaal per dag gedurende de eerste 10 dagen, en ten minste eenmaal per dag daarna. Voer een autopsie onmiddellijk als een muizen sterven tijdens Angll infusie. Verwijder wondklemmen tussen 7 – 14 dagen na de operatie. 6. Oogsten, reparatie, reiniging en Imaging van de aorta Opengesneden de muis borst- en buikholte ventraal, snijd open rechter atrium, perfuseren met een zoutoplossing door de linker ventrikel van het hart om bloed in de aorta te verwijderen, en dan oogsten van de aorta 27. Plaats geoogst aorta in plastic buizen die ten minste 3 ml van 4% paraformaldehyde en 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 24 – 48 uur 27. Verwijder adventitiale weefsels zorgvuldig. Pin aorta op zwart was met pinnen. Verwerven aorta beelden met dezelfde vergroting. Neem een liniaal in elk voor kalibratie, zie figuur 3. 7. En face Imaging van de aorta Opengesneden aorta lengterichting door de buitenste en binnenste kromming van aortaboog en opengesneden grote takken waaronder innominate, linker halsslagader en linker subclavia. Pin aorta vlak met buitenste adventitiale leggen naast de zwarte was. Verwerven en face beeld van het oppervlak van intimale aorta bij dezelfde vergroting. Zoals een heerser in elk beeld voor de kalibratie, zoals getoondn in figuur 4.

Representative Results

De 4 male LDL receptor – / – muizen in het protocol beschreven werden gedood na 4 weken van Angll infusie. Aorta's werden geoogst, schoongemaakt, en afgebeeld aan de aorta dilations visualiseren. Zoals getoond in figuur 3, aorta's hebben verschillende kenmerken, zoals uitbreiding van de suprarenale gebied (AAA Figuur 3A), uitbreiding van de opgaande gebied (TAA Figuur 3B) of expansie van beide gebieden (aanwezigheid van zowel AAAs en TAA Figuur 3C), terwijl de morfologie in één muis was schromelijk normaal (Figuur 3D). Verwijding van de abdominale aorta wordt gekwantificeerd door de ex vivo maximale breedte van de suprarenale regio, zoals blijkt uit de rode lijn in figuur 3A. Meten stijgende aorta dilatatie werden aorta opengesneden en vastgezet zoals weergegeven in figuur 4. Intimale oppervlaktegebied werd gemeten in de opgaande aorta gebied (gebied omringd door the rode lijnen in Figuur 4A) kwantificeerbaar TAA's. Een liniaal was in elk beeld om metingen te standaardiseren, zoals weergegeven in beide figuren 3 en 4. . Figuur 1. representatief beeld van gevulde osmotische pomp Elke pomp bestaat uit twee afzonderlijke delen: een hoofdlichaam en een stroom moderator. Na het vullen van het pomphuis met AngII, wordt de stromingsmoderator ingebracht om de pomp af te dichten. Figuur 2. Proces pomp implantatiechirurgie (A) Mouse wordt in een laminaire kap met een neuskegel die ze continue isofluraan en zuurstof.; (B) Een rechte hemostaat wordt in de huid incisie met een subcutane tunnel maken ingebracht; (C) Pomp wordt door de ingebracht huidincisie zachtjes; (D) De huid incisie wordt geniet na de pomp inbrengen. Figuur 3. Aorta afbeeldingen (ex vivo) van muizen toegediend met AngII AngII 1000 ng / kg / min werd toegediend bij mannelijke LDL receptor -. / – Muizen gedurende 28 dagen. (A) AAAs vergezeld trombose; Rode lijn (2,05 mm) geeft de meting van de maximale breedte van de aorta in de bijnieren regio. (B) oplopend aorta dilatatie (TAA) met grove normale abdominale aorta; (C) Profound verwijdingen in zowel de opgaande en suprarenale aorta regio's (TAA's en AAA); (D) grove normale aorta zonder duidelijke verwijding van oplopende of suprarenale aorta regio. 4.jpg "/> Figuur 4. En gezichtsbeelden van thoracale aorta's van muizen toegediend met AngII AngII 1000 ng / kg / min werd toegediend bij mannelijke LDL receptor -. / – Muizen gedurende 28 dagen. Oppervlakte met een rode lijn geschetst representeert de oplopende aorta-regio, inclusief een deel van de aortaboog. 1 Dosis nodig 1000 ng / kg / min 2 Start lichaamsgewicht (grootste muis) 24.8 g 3 Totale geschatte gewichtstoename 1 g 4 Pompsnelheid 0.25 gl / hr 5 Number muizen 4 6 Dosis per uur voor dierlijke 1518 ng 7 Conc nodig 6072 ng / ul 8 Voor 300 ul oplossing 1.82 mg / 300 gl OPLOSSING NODIG 9 Totaal Angll (mg) 7.3 mg 10 Opgelost in een zoutoplossing &# 160; 1200 pi Muis Lichaamsgewicht Verdunningsfactor Volume (pl) Pomp Gewicht (g) Gevuld Ratio # (g) Angll Zoutoplossing Leeg Gevulde (%) 1 24.5 1.0 296,4 3.6 1,1443 1,3877 99 2 23.0 0.9 278,2 21.8 1,1677 1,4145 100 3 24.8 1.0 300,0 0.0 1,1438 1,3904 100 4 21.8 0.9 263,7 36.3 1,1438 1,3904 100 Verdunningsfactor = lichaamsgewicht van de muis / lichaamsgewicht van de grootste muis Muis Lichaamsgewicht Verdunningsfactor Volume (pl) Pomp Gewicht (g) Gevuld Ratio # (g) Angll Zoutoplossing Leeg Gevulde (%) 1 24.5 1.0 296,4 3.6 1,1443 1,3877 99 2 23.0 0.9 278,2 21.8 1,1677 1,4145 100 3 24.8 1.0 300,0 0.0 1,1438 1,3904 100 4 21.8 0.9 263,7 36.3 1,1438 1,3904 100 Tabel 1: Berekening voor 28-daagse infusie via osmotische pompen.

Discussion

Osmotische pompen leveren Angll subcutaan is een routine benadering induceren aorta aneurysma's in muizen. Op basis van gegevens uit vele laboratoria, zijn er consistente bevindingen dat dit een betrouwbare en reproduceerbare wijze zowel AAAs 3,4 en TAA's 22-26 in muizen te bestuderen. Daarom wordt dit muismodel als een model dat verschillende kenmerken van de menselijke aorta aneurysma recapituleert en geeft mechanistische inzicht in deze verwoestende ziektes.

Hoewel veroudering een risicofactor voor AAAs bij de mens, het is niet systematisch onderzocht voor Angll geïnduceerde AAA bij muizen. Toch lijkt incidentie en ernst van Angll-geïnduceerde AAAs vergelijkbaar in muizen op de leeftijd van 8 – 48 weken 4,5,7. Momenteel zijn er slechts enkele studies rapporteren AngII geïnduceerde TAA's in muizen op de leeftijd van 8 – 24 weken 22-26, die duidelijk leeftijdsgebonden verschillen op TAA formatie niet vertoonde.

Vrouwelijke muizen hebben een veel lagere incidentie van AAA dan mannelijke muizen toegediend met AngII 4,28. Het is vermeldenswaard dat de incidentie van Ang II geïnduceerde AAA veel hoger dan in hyper- normo-cholesterolemic muizen, die meer dan 50% versus minder dan 30%, respectievelijk. Daarnaast aortaruptuur is frequent (ongeveer 10 – 30%) in zowel normo- en hypercholesterolemie muizen tijdens Angll infusie. Infusie van Angll een snelheid van 1000 ng / kg / min in hypercholesterolemische muizen, zoals LDL receptor – / – muizen die een westers dieet of apolipoproteïne (apoE) – / – muizen die een normale of westers dieet heeft maximale effecten op AAA ontwikkeling 3,4,29. Dit infusiesnelheid is optimaal voor een studie waarin het manipuleren van een gen van interesse in hypercholesterolemische muizen verwacht AAA verminderen. Als een manipulatie hypercholesterolemische muizen verwacht vergroten AAA, wordt aanbevolen AngII infusie met een snelheid van 500 ng / kg / min of lager 30. In tegenstelling tot AAAs, is er geen demonstratienstrated associatie tussen mannelijk geslacht of hypercholesterolemie en Angll geïnduceerde TAA's 25. Echter, net als bij AAAs als manipulatie van een gen van belang wordt verwacht vergroten TAA aanbevolen een lagere infusiesnelheid dan 1000 ng / kg / min gedurende Angll infusie.

Het is ook belangrijk te weten dat de incidentie en ernst van Angll-geïnduceerde aorta aneurysma variëren tussen individuele muizen en tussen studies. Als muizen niet aorta aneurysma ontwikkelen één potentiële mogelijkheid is dat Angll mogelijk niet succesvol in muizen opgeleverd. Voor de validatie van een hoge infusiesnelheid van AngII, zoals de 1000 ng / kg / min, het meten van de bloeddruk wordt aanbevolen vóór en tijdens Angll infusie met behulp van een niet-invasieve staart-cuff-methode 31. Angll infuus met een snelheid van 1000 ng / kg / min stijgt systolische bloeddruk bij muizen. Ook kan het plasma renine concentraties gedurende Angll infusie of bij beëindiging sinds Angll heeft een negatieve feedback op r worden gemetenENIN secretie. Daarom Angll infusie leidt tot verlaging van plasma renine concentratie. Als een muis doordrenkt met AngII geen duidelijk aorta pathologieën, geen toename van de bloeddruk, en geen afname van plasma renine concentratie zou aangeven dat Angll is niet efficiënt via geïmplanteerde osmotische minipomp opgeleverd. Wij raden het verwijderen van deze muis uit de studie. Het is ook belangrijk op te merken dat sommige muizen niet ontwikkelen aorta-aneurysma's ondanks de toegenomen systolische bloeddruk en verminderde plasma renine concentraties. Indien deze muizen in de studie blijven.

Samenvattend wordt AngII infuus bereikt door subcutane implantatie via osmotische pompen aorta aneurysma's bij de muis. Deze methode levert AngII constant bij een bepaalde snelheid van de aangewezen tijdsduren die worden gebruikt om zowel AAAs en TAA's te bestuderen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The research work presented in this manuscript was supported by a grant (HL107319 to Alan Daugherty and HL107326 to Lisa A. Cassis) from the National Institutes of Health of the United States of America. The content in this manuscript is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. The publication of this manuscript was sponsored by DURECT Corporation.

Materials

Angiotensin II Bachem H-1705 compound used to induce aortic aneurysms
Alzet Osmotic Pumps DURECT Corporation Alzet Model 2004 feasible for 28-day infusion in mice weighed > 20 g
Saturated fat-enriched diet Harlan Teklad TD.88137 42% calories/calories to stimulate hypercholesterolemia in LDL receptor -/- mice
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1649 (2000).
  2. Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).
  3. Daugherty, A., Cassis, L. Chronic angiotensin II infusion promotes atherogenesis in low density lipoprotein receptor -/- mice. Ann NY Acad Sci. 892 (1), 108-118 (1999).
  4. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 105 (11), 1605-1612 (2000).
  5. Deng, G. G., et al. Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm. Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).
  6. King, V. L., Trivedi, D., Gitlin, J. M., Loftin, C. D. Selective cyclooxygenase-2 inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 1137-1143 (2006).
  7. Uchida, H. A., Poduri, A., Subramanian, V., Cassis, L. A., Daugherty, A. Urokinase-type plasminogen activator deficiency in bone marrow-derived cells augments rupture of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2845-2852 (2011).
  8. Wang, Y. X., et al. Angiotensin II increases urokinase-type plasminogen activator expression and induces aneurysm in the abdominal aorta of apolipoprotein E-deficient mice. Am J Pathol. 159 (4), 1455-1464 (2001).
  9. Bruemmer, D., et al. Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest. 112 (9), 1318-1331 (2003).
  10. Gavrila, D., et al. Vitamin E inhibits abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-infused apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (8), 1671-1677 (2005).
  11. Wang, J., et al. IgE actions on CD4+ T cells, mast cells, and macrophages participate in the pathogenesis of experimental abdominal aortic aneurysms. EMBO Mol Med. 6 (7), 952-969 (2014).
  12. Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
  13. Usui, F., et al. Inflammasome activation by mitochondrial oxidative stress in macrophages leads to the development of angiotensin II-induced aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 127-136 (2015).
  14. Mellak, S., et al. Angiotensin II mobilizes spleen monocytes to promote the development of abdominal aortic aneurysm in apoe-/- mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 378-388 (2015).
  15. Krishna, S. M., et al. Peptide antagonist of thrombospondin-1 promotes abdominal aortic aneurysm progression in the angiotensin II-infused apolipoprotein-E-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 389-398 (2015).
  16. Norman, P. E., Curci, J. A. Understanding the effects of tobacco smoke on the pathogenesis of aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1473-1477 (2013).
  17. Daugherty, A., Powell, J. T. Recent highlights of ATVB: aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 691-694 (2014).
  18. Liu, J., Daugherty, A., Lu, H. Angiotensin II and abdominal aortic aneurysms: an update. Curr Pharm Design. , (2015).
  19. Rateri, D. L., Howatt, D. A., Moorleghen, J. J., Charnigo, R., Cassis, L. A., Daugherty, A. Prolonged infusion of angiotensin II in apoE(-/-) mice promotes macrophage recruitment with continued expansion of abdominal aortic aneurysm. Am J Pathol. 179 (3), 1542-1548 (2011).
  20. Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1621-1626 (2003).
  21. Daugherty, A., Cassis, L. A., Lu, H. Complex pathologies of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. J Zhejiang Univ Sci B. 12 (8), 624-628 (2011).
  22. Daugherty, A., Rateri, D. L., Charo, I. F., Owens, A. P., Howatt, D. A., Cassis, L. A. Angiotensin II infusion promotes ascending aortic aneurysms: attenuation by CCR2 deficiency in apoE-/- mice. Clin Sci (Lond). 118 (11), 681-689 (2010).
  23. Rateri, D. L., et al. Endothelial cell-specific deficiency of Ang II type 1a receptors attenuates Ang II-induced ascending aortic aneurysms in LDL receptor-/- mice). Circ Res. 108 (5), 574-581 (2011).
  24. Rateri, D. L., et al. Depletion of endothelial or smooth muscle cell-specific angiotensin II type 1a receptors does not influence aortic aneurysms or atherosclerosis in LDL receptor deficient mice. PLoS One. 7 (12), 10-1371 (2012).
  25. Rateri, D. L., et al. Angiotensin II induces region-specific medial disruption during evolution of ascending aortic aneurysms. Am J Pathol. 184 (9), 2586-2595 (2014).
  26. Davis, F. M., et al. Smooth muscle cell deletion of low-density lipoprotein receptor-related protein 1 augments angiotensin II-induced superior mesenteric arterial and ascending aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 155-162 (2015).
  27. Daugherty, A., Rateri, D. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36 (2), 129-138 (2005).
  28. Henriques, T. A., Huang, J., D’Souza, S. S., Daugherty, A., Cassis, L. A. Orchidectomy, but not ovariectomy, regulates angiotensin II-induced vascular diseases in apolipoprotein E-deficient mice. Endocrinology. 145 (8), 3866-3872 (2004).
  29. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis. Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).
  30. Wang, S., et al. Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms. Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).
  31. Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. J Vis Exp. (27), e1291 (2009).

Tags

Subcutaneous InfusionAngiotensin IIOsmotic PumpsAortic AneurysmsMiceHypercholesterolemiaGender DependenceAbdominal Aortic AneurysmsThoracic Aortic Aneurysms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lu, H., Howatt, D. A., Balakrishnan, A., Moorleghen, J. J., Rateri, D. L., Cassis, L. A., Daugherty, A. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J. Vis. Exp. (103), e53191, doi:10.3791/53191 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image