تحت الجلد أنجيوتنسين II تسريب باستخدام الأسموزي مضخات يقنع الأورطي تمدد الأوعية الدموية في الفئران
Summary
يوفر زرع تحت الجلد من مضخات التناضحي نهج مناسب للتسليم لفترات طويلة وثابت من المركبات. وقد استخدم هذا الأسلوب على نطاق واسع لدراسة كل تمدد الشريان الأورطى البطنى والصدر في الفئران.
Abstract
Osmotic pumps continuously deliver compounds at a constant rate into small animals. This article introduces a standard protocol used to induce aortic aneurysms via subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) from implanted osmotic pumps. This protocol includes calculation of AngII amount and dissolution, osmotic pump filling, implantation of osmotic pumps subcutaneously, observation after pump implantation, and harvest of aortas to visualize aortic aneurysms in mice. Subcutaneous infusion of AngII through osmotic pumps following this protocol is a reliable and reproducible technique to induce both abdominal and thoracic aortic aneurysms in mice. Infusion durations range from a few days to several months based on the purpose of the study. AngII 1,000 ng/kg/min is sufficient to provide maximal effects on abdominal aortic aneurysmal formation in male hypercholesterolemic mouse models such as apolipoprotein E deficient or low-density lipoprotein receptor deficient mice. Incidence of abdominal aortic aneurysms induced by AngII infusion via osmotic pumps is 5 – 10 times lower in female hypercholesterolemic mice and also lower in both genders of normocholesterolemic mice. In contrast, AngII-induced thoracic aortic aneurysms in mice are not hypercholesterolemia or gender-dependent. Importantly, multiple features of this mouse model recapitulate those of human aortic aneurysms.
Introduction
تمدد الشريان الأورطى يحمل التوسع اللمعية الدائمين في الشريان الأورطي الذي ينذر تمزق ويؤدي إلى الوفاة عادة. يحدث هذا المرض في كل من المناطق الأبهر في البطن والصدر، والتي توصف بأنها تمدد الأوعية الدموية في البطن الأورطي (تمدد) وتمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري (TAAS)، على التوالي. بسبب نقص فهم الآليات الجزيئية والعمليات الفسيولوجية المرضية، لا يوجد علاج طبي ثبت التي يمكن أن تمنع توسع أو تمزق أي نوع من تمدد الشريان الأورطى. وبما أنه من الصعب الحصول على عينات المريض وإجراء التجارب على البشر مباشرة، والبحوث التي تركز على تحديد آليات تمدد تم في كثير من الأحيان استقراء من نماذج حيوانية. A نموذج حيواني شيوعا هو التسريب تحت الجلد أنجيوتنسين II (AngII) في الفئران. مقارنة مع النهج جراحية أخرى لإحداث تمدد في الفئران، مثل داخل الأبهر نضح الإيلاستاز أو تطبيق شبه الأبهري من كلوريد الكالسيوم التي تتطلب فتح البطن 1،2، هذا methoد لا تتطلب الدخول إلى تجويف الجسم وتتطلب الحد الأدنى من الخبرة الجراحية 3،4.
وذكر التسريب تحت الجلد AngII من خلال مضخات التناضحي للحث على التمدد في البداية في منخفض الكثافة البروتين الدهني (LDL) مستقبلات – / – الفئران التي غذيت على التخصيب الدهون النظام الغذائي المشبع 3، وبعد ذلك في APOE – / – تغذية الفئران حمية مختبر طبيعي 4. وقد أثبتت العديد من الدراسات الحديثة أيضا أن AngII يدفع تمدد في الفئران normolipidemic 5-7. وقد تم تطبيق هذا النهج من غرس AngII للحث على التمدد واستكشاف الآليات الجزيئية فضلا عن وضع استراتيجيات علاجية محتملة (على سبيل المثال، 5-15) لأن هذا النموذج يلخص العديد من الميزات التي لوحظت في تمدد الإنسان. على سبيل المثال، عوامل خطر تمدد الإنسان مثل التدخين، والشيخوخة، والذكورة أيضا تزيد تمدد AngII التي يسببها في الفئران 16،17. جمعية فرط كوليسترول الدم مع تمدد في البشر يتطلب التوضيح. ومع ذلك، فقد يكونأون يتفق أن ارتفاع الكولسترول تقوي AngII الناجم عن تمدد في الفئران 18. الأمراض من تمدد AngII التي يسببها في الفئران هي غير متجانسة للغاية وتتميز تسلل عميق بلعم، وتدهور الكولاجين، وتشكيل الجلطات والقرار، واتساع الأوعية الدموية 19-21. وعلى النقيض من موقع الأبهر infrarenal الأكثر شيوعا للتمدد في البشر، AngII الناجم عن تمدد في الفئران تحدث في منطقة الأبهري الكظرية. ميزة في كل مكان آخر من AngII التي يسببها التمدد هو كسر وسطي بطريق، مما يؤدي إلى تجلط الدم بطريق. ومن غير الواضح ما إذا كان بطريق الإيلاستين تمزق يحدث في البشر منذ المرضية الناتجة عن التمدد في البشر لم يتم دراستها بشكل خاص نظرا لعدم وجود أنسجة أم الدم من المراحل السابقة.
AngII التسريب في الفئران يؤدي أيضا إلى التوسع العميق للمنطقة الأبهري الصدري، أن يقتصر في الغالب إلى الأبهر الصاعد والذي هو المنطقة الأكثر شيوعا لTAAS في البشر <sتصل> 19،22-26. على غرار تمدد AngII التي يسببها، TAAS المستحثة خلال AngII التسريب أيضا تلخيص العديد من الميزات من البشر TAAS 25. ومع ذلك، وعلى النقيض من تمدد AngII التي يسببها، لا ترتبط TAAS AngII التي يسببها مع ارتفاع الكولسترول وليس لديهم الفروق بين الجنسين.
الهدف العام المتمثل في ضخ AngII تحت الجلد في الفئران هو دراسة الخصائص المرضية والآليات الجزيئية للتمدد وTAAS.
Protocol
Representative Results
Discussion
مضخات التناضحي تقديم AngII تحت الجلد هو نهج روتيني لإحداث تمدد الشريان الأورطى في الفئران. استنادا إلى بيانات من العديد من المختبرات، كانت هناك نتائج متسقة أن هذه هي طريقة موثوق بها وقابلة للتكرار لدراسة كل تمدد 3،4 وTAAS 22-26 في الفئران. ولذلك، يعتبر هذا نموذج الفأر نموذجا يلخص العديد من الميزات من تمدد الشريان الأورطى الإنسان، ورؤى الآلية الخاصة بمثل هذه الأمراض المدمرة.
بينما الشيخوخة هو أحد عوامل الخطر لتمدد في البشر، فإنه لم يدرس بشكل منهجي للتمدد AngII التي يسببها في الفئران. ومع ذلك، يبدو حدوث وشدة تمدد AngII التي يسببها تشبه في الفئران في سن 8-48 أسابيع 4،5،7. حاليا، لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات الإبلاغ TAAS AngII التي يسببها في الفئران في سن 8-24 أسابيع 22-26، والتي لم تظهر الفروق المرتبطة بالعمر واضحة على تشكيل TAA.
الفئران الإناث لديهم معدلات أقل بكثير من التمدد من الفئران الذكور التي غرست مع AngII 4،28. ومن الجدير بالذكر أيضا أن وقوع AngII التي يسببها التمدد هو أعلى من ذلك بكثير في فرط من الفئران normo-cholesterolemic، التي هي أكثر من 50٪ مقابل أقل من 30٪، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، وتمزق الأبهر المتكرر (حوالي 10-30٪) في كل من الفئران normo- ومفرط كوليستيرول الدم خلال AngII التسريب. ضخ AngII بمعدل 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة في الفئران مفرط كوليستيرول الدم، مثل LDL مستقبلات – تغذية الفئران غذاء غربيا أو ئي (APOE) – – / / – تغذية الفئران اتباع نظام غذائي عادي أو غربي، له آثار القصوى على AAA تطوير 3،4،29. هذا المعدل التسريب هو الأمثل لدراسة شارك فيها التلاعب الجيني للاهتمام في الفئران مفرط كوليستيرول الدم ومن المتوقع للحد من التمدد. إذا كان من المتوقع التلاعب في الفئران مفرط كوليستيرول الدم لزيادة التمدد، فمن المستحسن للبث AngII بمعدل 500 نانوغرام / كغ / دقيقة أو أقل 30. في المقابل إلى التمدد، لا يوجد تجريبيجمعية nstrated بين الجنسين من الذكور أو ارتفاع الكولسترول وAngII التي يسببها TAAS 25. ومع ذلك، على غرار تمدد، إذا كان من المتوقع التلاعب في الجينات التي تهم زيادة TAAS، نوصي معدل ضخ أقل من 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة لAngII التسريب.
ومن المهم أيضا أن نعرف أن حدوث وشدة تمدد الشريان الأورطى AngII التي يسببها تختلف بين الفئران الفردية وبين الدراسات. إذا الفئران لا تتطور تمدد الشريان الأورطى، إمكانية محتملة واحدة هي أن AngII قد لم يتم تسليمها بنجاح في الفئران. للتأكد من صحة معدل ضخ عالية من AngII، مثل 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة، وينصح بقياس ضغط الدم قبل وأثناء، AngII التسريب باستخدام غير الغازية طريقة الذيل الكفة 31. AngII ضخ بمعدل 1000 نانوغرام / كغ / دقيقة يزيد ضغط الدم الانقباضي لدى الفئران. أيضا، يمكن قياس تركيزات الرينين البلازما خلال AngII التسريب أو في إنهاء منذ AngII ديه ردود فعل سلبية على صإفراز العينين. ولذلك، AngII ضخ يؤدي إلى تخفيضات في تركيزات الرينين البلازما. إذا كان الماوس يملؤه AngII لا يوجد لديه الأمراض الظاهرة الأبهري، أي زيادة ضغط الدم، وأي انخفاض تركيز الرينين البلازما، فإنه يشير إلى أن AngII لم يتم تسليمها بكفاءة من خلال زرع مضخة صغيرة التناضحي. نود أن نوصي إزالة هذا الفأر من الدراسة. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن بعض الفئران لا تتطور تمدد الشريان الأورطى على الرغم من زيادة الضغوط الدم الانقباضي وانخفضت تركيزات الرينين البلازما. ينبغي أن تظل هذه الفئران في الدراسة.
باختصار، ويتحقق AngII التسريب عن طريق زرع تحت الجلد باستخدام مضخات التناضحي للحث على تمدد الشريان الأورطى في الفئران. هذه الطريقة توفر AngII باستمرار بمعدل محددة لفترات المعينة التي تستخدم لدراسة كل تمدد وTAAS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research work presented in this manuscript was supported by a grant (HL107319 to Alan Daugherty and HL107326 to Lisa A. Cassis) from the National Institutes of Health of the United States of America. The content in this manuscript is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. The publication of this manuscript was sponsored by DURECT Corporation.
Materials
| Angiotensin II | Bachem | H-1705 | compound used to induce aortic aneurysms |
| Alzet Osmotic Pumps | DURECT Corporation | Alzet Model 2004 | feasible for 28-day infusion in mice weighed > 20 g |
| Saturated fat-enriched diet | Harlan Teklad | TD.88137 | 42% calories/calories to stimulate hypercholesterolemia in LDL receptor -/- mice |
References
- Pyo, R., et al. Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms. J Clin Invest. 105 (11), 1641-1649 (2000).
- Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride. J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).
- Daugherty, A., Cassis, L. Chronic angiotensin II infusion promotes atherogenesis in low density lipoprotein receptor -/- mice. Ann NY Acad Sci. 892 (1), 108-118 (1999).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J Clin Invest. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Deng, G. G., et al. Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm. Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).
- King, V. L., Trivedi, D., Gitlin, J. M., Loftin, C. D. Selective cyclooxygenase-2 inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 1137-1143 (2006).
- Uchida, H. A., Poduri, A., Subramanian, V., Cassis, L. A., Daugherty, A. Urokinase-type plasminogen activator deficiency in bone marrow-derived cells augments rupture of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (12), 2845-2852 (2011).
- Wang, Y. X., et al. Angiotensin II increases urokinase-type plasminogen activator expression and induces aneurysm in the abdominal aorta of apolipoprotein E-deficient mice. Am J Pathol. 159 (4), 1455-1464 (2001).
- Bruemmer, D., et al. Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated in osteopontin-deficient mice. J Clin Invest. 112 (9), 1318-1331 (2003).
- Gavrila, D., et al. Vitamin E inhibits abdominal aortic aneurysm formation in angiotensin II-infused apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (8), 1671-1677 (2005).
- Wang, J., et al. IgE actions on CD4+ T cells, mast cells, and macrophages participate in the pathogenesis of experimental abdominal aortic aneurysms. EMBO Mol Med. 6 (7), 952-969 (2014).
- Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
- Usui, F., et al. Inflammasome activation by mitochondrial oxidative stress in macrophages leads to the development of angiotensin II-induced aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 127-136 (2015).
- Mellak, S., et al. Angiotensin II mobilizes spleen monocytes to promote the development of abdominal aortic aneurysm in apoe-/- mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 378-388 (2015).
- Krishna, S. M., et al. Peptide antagonist of thrombospondin-1 promotes abdominal aortic aneurysm progression in the angiotensin II-infused apolipoprotein-E-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (2), 389-398 (2015).
- Norman, P. E., Curci, J. A. Understanding the effects of tobacco smoke on the pathogenesis of aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1473-1477 (2013).
- Daugherty, A., Powell, J. T. Recent highlights of ATVB: aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 691-694 (2014).
- Liu, J., Daugherty, A., Lu, H. Angiotensin II and abdominal aortic aneurysms: an update. Curr Pharm Design. , (2015).
- Rateri, D. L., Howatt, D. A., Moorleghen, J. J., Charnigo, R., Cassis, L. A., Daugherty, A. Prolonged infusion of angiotensin II in apoE(-/-) mice promotes macrophage recruitment with continued expansion of abdominal aortic aneurysm. Am J Pathol. 179 (3), 1542-1548 (2011).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Daugherty, A., Cassis, L. A., Lu, H. Complex pathologies of angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms. J Zhejiang Univ Sci B. 12 (8), 624-628 (2011).
- Daugherty, A., Rateri, D. L., Charo, I. F., Owens, A. P., Howatt, D. A., Cassis, L. A. Angiotensin II infusion promotes ascending aortic aneurysms: attenuation by CCR2 deficiency in apoE-/- mice. Clin Sci (Lond). 118 (11), 681-689 (2010).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial cell-specific deficiency of Ang II type 1a receptors attenuates Ang II-induced ascending aortic aneurysms in LDL receptor-/- mice). Circ Res. 108 (5), 574-581 (2011).
- Rateri, D. L., et al. Depletion of endothelial or smooth muscle cell-specific angiotensin II type 1a receptors does not influence aortic aneurysms or atherosclerosis in LDL receptor deficient mice. PLoS One. 7 (12), 10-1371 (2012).
- Rateri, D. L., et al. Angiotensin II induces region-specific medial disruption during evolution of ascending aortic aneurysms. Am J Pathol. 184 (9), 2586-2595 (2014).
- Davis, F. M., et al. Smooth muscle cell deletion of low-density lipoprotein receptor-related protein 1 augments angiotensin II-induced superior mesenteric arterial and ascending aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (1), 155-162 (2015).
- Daugherty, A., Rateri, D. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36 (2), 129-138 (2005).
- Henriques, T. A., Huang, J., D’Souza, S. S., Daugherty, A., Cassis, L. A. Orchidectomy, but not ovariectomy, regulates angiotensin II-induced vascular diseases in apolipoprotein E-deficient mice. Endocrinology. 145 (8), 3866-3872 (2004).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis. Br J Pharmacol. 134 (4), 865-870 (2001).
- Wang, S., et al. Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms. Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).
- Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. J Vis Exp. (27), e1291 (2009).
